基因操作豪原理04.ppt

;;2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 优点: 分离率高 1 bp, 点样量高 10?g 回收的DNA纯度高 非变性: 迁移率与序列和组成有关 变性(尿素/甲醛): 无关，分离探针，S1酸产物分析，DNA测序;三、DNA片段的纯化（从agarose） 1.低熔点agarose电泳 gel + 5vol tris 65℃ 5min phenol extract ethanol 2.透析袋，电洗脱法 可用于?5kb 3.Glass Milk (bead) 3M NaI 溶液，bead吸附 洗涤 elute 4.Kit Qiagen 公司;一个典型哺乳动物细胞约含 10-5?g RNA，其中80-85%为rRNA(28S,18S和5S/23S,16S,5S)三种类型)，其余15～20%主要由各种类型的低分子量RNA组成（如tRNA，核内小分子RNA等）。 mRNA为总RNA的1～5%，3‘端有一个poly(A)尾，可与oligo(dT)-纤维素，吸附，亲和层析分离寡脱氧胸苷酸。;一、注意事项控制RNA酶的活性 (一) 实验用具和溶液的去RNA酶处理 1. 玻璃制品、塑料制品、电泳槽 一次性使用用品/第一次使用的用具，可稍作处理 器皿：180℃ 8hr or longer， 氯仿冲洗/NaOH/专用溶液 0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)、浸泡(37℃，2hr) (RNA酶的强列抑制剂，但不绝对) 无菌水(or DEPC水)洗涤 100℃烤15min→湿热灭菌;电泳槽: 洗净,水冲洗, 乙醇干燥 3%H2O2 10min 0.1% DEPC H2O 水洗 2．H2O：0.1% DEPC 溶液：用DEPC水配制 （注意有些药品，不能用DEPC,如Tris） 3．其它 如手套，保持干净、清洁 ;（二）RNA酶抑制剂 1．蛋白质抑制剂 人胎盘RNase抑制剂 2．氧铜核糖核苷复合物 100%抑制（且抑制体外翻译） 3．硅藻土，吸附RNase;二、RNA的抽提 1．文献法 2．Kit Gibco/TR1ZOL Reagent 100ml 99.8USD 酚+异硫氰酸胍 Qiagen/RNAeasy;四、mRNA的纯化 1．亲和层析 2．纯度检测 OD260: 1=40?g/ml RNA;1．检测蛋白质分子量 2．Western blot 3．N-torminal amino acid sequence;第四节 分子杂交 molecular hybridization;1. 根据被杂交的对象分为 Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque) 2.denature变性：热，极端pH，有机溶剂，尿素 annealing复性： 互补单链重新配对恢复成双链为复性 hybridization杂交： 同源单链重新配对恢复成双链为杂性;一、Southern blot (一)　DNA片段的转移 1．酶切 2．电泳/照相　　　中性／碱性（0.4N, NaOH） 3. 变性/中和 大片段 脱嘌呤 0.2N, HCl 10min 0.5N NaOH/1.5M NaCl 1M Tris(pH7.4)/1.5M NaCl ;4. 转移 Nitrocellulose membrane NC nylon membrane (charged or not) 6×SSC (or SSPE)转移 buffer 毛细管 电转移 真空;;5．固定 80℃ 2hr, UV, microwave;(二) 杂交 hybridization 1. 预杂交prehybridization 6×SSC Denhardt(50x)：(含Ficoll,聚乙烯比咯烷酮) 变性鱼精DNA 0.5% SDS;2. 杂交 · 探针处理 · 温度 42℃ 50%甲酰胺 · 时间 6-8小时 探针：DNA, Oligo, 随机DNA ;;（三）检测 X-film or 生化 ;;;;（四）探针的标记 probe labeling 1．均一标记 切口平移nick traslation: E.coli DNA polyI 随机引物 random primer: 6Nt or 6～12nt klenow 2．单链探针 ssD