实验六抗体效价的Elisa测定 .pptx

实验六 抗体效价的Elisa测定; 60年代初期,Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特别的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体,统称为酶标记物或酶结合物,用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定;酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。;1974年 Voller等 用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(???原),再与相应的酶标记物结合 操作更方便,易重复 灵敏度可高达ng(10-9g)至pg(10-12g), ;(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay);免疫标记技术;应用各种液相和固相免疫分析方法,对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定;酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色,便于检测 常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。;戊二醛法, 过碘酸氧化法 将酶与Ab交联在一起;图一　　直截了当型Elisa;图二　　间接型Elisa;图三 双抗体夹心型ELISA;图四 固相抗体竞争型ELISA 未知抗原量=A(1)-A(2);每次反应后都要反复洗涤？ 保证反应的定量反应 防止重叠反应,引起非特异现象。;Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA plate Patient serum which contains antibodies、 If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate、 Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme、 This is the second antibody, and it binds to human antibodies、 substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody、;positive;Protein protein interaction---ELISA;2、petitive elisa same epitope Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein;4、 操作方法 4、1 包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml,每凹孔加100μL,加盖置4℃过夜(37 ℃ 2h)【已完成】 次日倾去凹孔内液体,用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释/洗涤液洗涤3次,首次洗涤静置2min后倾去,后两次静置1min。将反应板扣放在滤纸上,以除净液体。 4、2 封闭: 每孔中加满封闭液(约300ul多),加盖或用封口膜封板,置37℃恒温箱60min,倾去孔内液体,按上法洗涤3次。;4、3 加待测血清(内含抗体)、阴性血清(无抗体)及稀释液(PBS/Tween): 待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等),阴性血清也稀释成1:100,取不同稀释度的待测血清,阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各1OOμL加至相应的凹孔中,加盖或封板,置37℃恒温箱1h,使抗体与固相抗原进行特异性结合,反复洗涤3次。;1 2 3 4 5 6 7 8;4、4 加酶标抗体:加入HRP-抗体(抗抗体,本实验中差不多依照说明书稀释一千倍),每孔加l00μL,封板后置37℃温育lh,按上法至少洗涤5次,最后用蒸馏水洗涤2次,扣在滤纸上吸干水分。 4、5 显色: 首先按每10mLOPD应用液加入0、15mLH2O2处理。每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处5～30min。当显示明显黄色时应及时终止反应。 4、6 终止反应:每孔加入10OμL 2mol/L H2SO4。由黄色变为橙色。稳定3～5min即可比色测定。;4、7