苯酚法提取课件.pptx

苯酚法提取基本原理 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。因此,提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠(SDS)的缓冲液中,加等体积水饱和酚,通过剧烈振荡,然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相,被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相,或者在两相界面处形成凝胶层。基本原理 本实验采纳的0、15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离,而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离;用酚处理时DNA-蛋白复合物变性,在低温条件下从水相中除去,如此得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇接着处理RNA 制品,可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高,而且多呈自然状态,可供接着研究之用。主要试剂: (1)SDS-缓冲液:0、3％ SDS,0、1mol/L NaCl,0、05mol/L 乙酸钠,用乙酸调到pH5、0。SDS乙酸钠NaCl主要试剂(2)饱和酚液:重蒸苯酚用SDS溶液饱和。氯仿异戊醇液主要试剂(3)氯仿-异戊醇液:24﹕1(V/V)。主要试剂:(4)含2％乙酸钾的95％乙醇溶液。主要试剂:(5)无水乙醇(6)溶菌酶(B、R、(1mg/L)主要仪器:(1)台式高速离心机(10000r/min)主要仪器:(2)Eppendorf 管(50mL)主要仪器:紫外可见分光光度计主要仪器分析天平主要仪器真空干燥器主要仪器电子天平实验步骤:1、粗提取RNA 称量干燥的Eppendorf管的质量,取活性干酵母在研钵中研碎,取1g加入Eppendorf管,加10mL SDS-缓冲液使成匀浆。再加溶菌酶1mL,混匀,室温静置10min,再加10ml饱和酚液,室温下剧烈振荡5min,置冰浴中分层。实验步骤:2、分离RNA 在0～4℃低温环境下,10 000r/min 离心10min。吸出上层清液,转入新的Eppendorf 管。3、提纯RNA 加同上清液等体积氯仿-异戊醇,室温下剧烈振荡2、5min,然后10 000r/min 离心5min。吸出上层清液,转入另一新Eppendorf 管。实验步骤: 4、沉淀RNA 加2 倍体积95％乙醇(含2％乙酸钾),在冰浴中放置30min,使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min,弃上清液,实验步骤:5、洗涤RNA 沉淀用少许无水乙醇洗一次,迅速离心各1min,保留沉淀。倾去乙醚后,减压真空干燥,准确称重,记录。实验步骤:6、RNA 制品纯度的测定及RNA 提取率的计算 将干燥后RNA产品配制成浓度为10—50μg／ml的溶液,在紫外可见分光光度计上测定其260nm处的吸光度,按下式计算RNA制品纯度及RNA 提取率实验步骤:RNA含量=100% RNA提取率=式中,A260为260nm处的吸光度;L为比色杯光径(cm);0、024为lml溶液含lμgRNA的吸光度注意事项:1、注意安全,试验要用到的有机试剂有毒性,特别是重蒸酚。2、使用离心机时,对称的两只Eppendorf管的质量一定要相同,以保证重心在轴心上。感谢您的聆听！