westernblot的原理流程及常见问题分析.pptxVIP

第1页/共23页主要内容一、Western Blot 技术原理与实验流程二、Western Blot 技术常见问题分析第一页，编辑于星期日：八点 七分。第2页/共23页 Western Blot定义 Western Blot又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 Western Blot 应用目的： 检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中某种蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究第二页，编辑于星期日：八点 七分。第3页/共23页 Step5封闭Step6 免疫反应 Step7 检测Step1 蛋白提取Step3 SDSStep4 转膜Step2 蛋白定量 Western Blot实验流程第三页，编辑于星期日：八点 七分。第4页/共23页步骤一、蛋白提取 Bac-细菌蛋白抽提试剂 Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 Yea-酵母蛋白抽提试剂 Tis-组织蛋白抽提试剂 Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂确定蛋白位置，选择合适的蛋白抽提试剂 防止蛋白质的降解 冰上操作 加入蛋白酶抑制剂第四页，编辑于星期日：八点 七分。第5页/共23页检测范围：100-1,500 ug/ml BradfordLowryBCA检测范围： 1－1500ug/ml检测范围：20-2,000 ug/ml步骤二、蛋白定量第五页，编辑于星期日：八点 七分。第6页/共23页BCA定量 梯度稀释 在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。第六页，编辑于星期日：八点 七分。第7页/共23页 步骤三、SDS电泳上样前煮沸样品上样量：30-100 μg蛋白Marker第七页，编辑于星期日：八点 七分。第8页/共23页步骤四、转膜 膜的选择： NC、PVDF、尼龙膜 转膜方法： 半干转、湿转 转膜确认： 立春红染色、蛋白预染Marker3第八页，编辑于星期日：八点 七分。第9页/共23页膜的选择第九页，编辑于星期日：八点 七分。第10页/共23页转移方法半干转 用滤纸吸Buffer来做转移体系 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的， 时间是根据 蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h 湿转 将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h第十页，编辑于星期日：八点 七分。第11页/共23页-阴极+阳极多孔垫片膜滤纸滤纸凝胶 凝胶（Marker靠左） 2层滤纸 膜（左上角标记）转移操作 2层滤纸白色夹板（正极） 垫片300mA 1h 垫片56mA /膜 1h黑色夹板（负极）第十一页，编辑于星期日：八点 七分。第12页/共23页 转膜后确认丽春红可逆染色，检测转膜效率。与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。蛋白预染Marker实时监测分子量参照与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检测转膜效率。对转膜后的凝胶进行考染丽春红染色结果第十二页，编辑于星期日：八点 七分。第13页/共23页步骤五、封 闭去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 h 第十三页，编辑于星期日：八点 七分。第14页/共23页注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.步骤六、抗体孵育一抗的选择 ：确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等第十四页，编辑于星期日：八点 七分。第15页/共23页步骤六、抗体孵育 二抗的选择： 根据一抗物种：抗小鼠抗兔抗大鼠抗人抗山羊抗鸡抗豚鼠抗马 根据标记物：标记物HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记荧光标记抗体红色Cy3、TRITC、RRX、Texas Red X、Dylight549、Dylight 594、Dylight 649绿色FITC、Cy2、Dylight488蓝色AMCA近红外线Cy5第十五页，编辑于星期日：八点 七分。第16页/共23页步骤七、检测方法化学发光法： HRP酶标系统ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快； 特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。化学显色法： 酶标系统HRPTMB和DAB 酶标系统APBCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。第十六页，编辑于星期日：八点 七分。第17页/共23页推 荐对照设置 内参对照 beta-actin /beta-tubulin/GAP