体外培养血管平滑肌细胞的同步方法（临床医学资料）.doc

体外培养血管平滑肌细胞的同步方法（临床医学资料） 文档信息 属性： F-01NHH8，doc格式，正文23043字。质优实惠，欢迎下载！ 适用： 作为医学资料、临床医学资料写作的参考文献，解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容摘取等相关工作。 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：体外培养血管平滑肌细胞的同步方法 1 1 材料和方法 2 2 结果 4 3 讨论 5 文2：体外培养血管平滑肌细胞的同步方法 7 1 材料和方法 7 2 结果 9 3 讨论 10 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 体外培养血管平滑肌细胞的同步方法（临床医学资料） 文1：体外培养血管平滑肌细胞的同步方法 血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMC）的增殖和增生是动脉粥样硬化、 高血压、 冠状动脉腔内成型术术后再狭窄的主要病理表现, 引起VSMC增殖或增生的信号转导机制目前尚不完全清楚, 但揭示VSMC增生或增殖的信号通路具有重要意义, 而增殖信号转导最终的共同通路是细胞周期进展［1］。因此, 研究细胞周期与VSMC之间的关系, 建立有效的能将VSMC同步各个细胞周期阶段, 对于揭示动脉粥样硬化的发病机制具有重要的指导作用。以往一直着力于VSMC增殖方面的研究［2, 3］, 对于VSMC细胞周期同步化, 文献 报道采用血清饥饿法同步G0/G1期［4, 5］, 而对于G1期、 S期、 G2/M期的同步效果尚未见报道, 我们通过原代培养的大鼠VSMC, 采用胸苷、 秋水仙素同步化, 寻找同步方法的最佳条件, 利用流式细胞术（FCM）测定其同步效果, 分析在不同细胞周期中VSMC的DNA含量情况, 为冠状动脉粥样硬化的发病机制的研究提供实验基础。 1 材料和方法 材料 SD雄性大鼠（体质量120～150 g, 共20只）由第三军医大学实验动物研究所提供。DMEM（高糖型）培养基为Gibco公司产品、 胎牛血清购自杭州四季青, 胰酶（Amerisom）、 小鼠抗大鼠α-SM-actin购自武汉博士德公司, FITC标记抗小鼠IgG购自北京中杉公司, 胸苷、 秋水仙素、 DMSO、 MTT试剂均购自Sigma公司。 方法 大鼠VSMC原代培养及鉴定 (1)大鼠VSMC原代培养: 用1 g/L戊巴比妥钠 mL注入腹腔内, 麻醉SD大鼠, 无菌条件下分离全段胸主动脉血管, 置于含青霉素100 U/mL、 链霉素100 μg/L的无菌高糖DMEM中, 在细胞培养室用眼科镊夹取血管外层组织, DMEM培养基冲洗2遍, 眼科剪把血管剪开, 用棉签把内皮刮掉DMEM(含4 mL/L胎牛血清)清洗2遍, 眼科剪把其组织块剪碎成1 mm×1 mm大小组织块, 用眼科剪把组织块送入50 cm2培养瓶, 用吸管将其均匀分布, 将培养瓶翻转, 另一面加入3 mL DMEM(含200 mL/L胎牛血清), 3～4 h后翻正, 使组织块完全浸没于组织块中, 静置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱, 5～7 d可见组织块从周围游出, 80%～90%给予传代, 4～6代用于实验。每次取材2只SD大鼠, 总共20只。(2)大鼠VSMC鉴定: 用倒置显微镜观察细胞形态及生长方式。免疫荧光鉴定: 细胞爬片取出后 mol/L PBS()清洗5 min×3次; 用950 mL/L无水乙醇室温下固定20 min, 同上清洗; 100 mL/L正常山羊血清封闭液, 湿盒内温育30 min, PBS清洗; 加1∶100（小鼠抗大鼠α-SM-actin）, 置湿盒内4℃反应过夜, 同上清洗; 最后用1∶100(FITC-抗小鼠IgG), 湿盒内37℃孵育1 h, 同上清洗; 在荧光显微镜下观察拍照并保存。 大鼠血管平滑肌细胞细胞生长曲线的变化 以103～104/孔接种细胞于96孔培养板中, 按不同分组分别加200 μL含100 mL/L, 血清浓度的培养液, 于培养后第1天至第7天。绘制细胞生长曲线各组分别取3孔进行检测。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL, 置于恒温细胞培养箱继续培养4 h, 弃培养液, 加入DMSO 150 μL, 振荡10 min, 使结晶物充分溶解, 用酶标仪检测A490值。以天数为横轴, 吸光度为纵轴绘制细胞生长曲线。 细胞同步化 用双胸苷同步法使细胞同步化于G1期和S期［6］: 选取生长良好的细胞, 当其融合率达50%～60%, 首先加入胸苷使培养液的终浓度为2 mmol/L; 16 h后去除含胸苷的培养液, 并用 mol/L, 洗2次, 并加入新鲜的培养液培养1