(49)--8.2.3 发酵液的预处理和固液分离-微生物细胞的破碎.ppt

8发酵液预处理及发酵产物提取与精制

8.2发酵液的预处理和固液分离

8.2.4微生物细胞破碎

胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行固液分离，即可进行滤清液的分离。

胞内产物：某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。随着重组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等，基因在宿主细胞内克隆表达成为基因工程产品，其中许多存在于胞内。

分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。

四、细胞破碎

破碎方法

撞击法

液体剪切作用

固体剪切作用

高压匀浆

机械法

超声破碎

珠磨法

压榨法

1.组成：酵母纤维素，主要是葡萄糖、甘露醇及蛋白质

2.破碎阻力：细胞壁结构的紧密程度和厚度

1.组成：肽聚糖，聚糖链借助短肽交联而成

2.破碎阻力：肽聚糖的网状结构

1.组成：多糖，由几丁质和葡聚糖构成

2.破碎阻力：细胞壁的强度和聚合物的网状结构

四、细胞破碎---微生物细胞壁的组成与结构

细胞破碎阻力主要来自细胞壁。细胞的细胞壁固定细胞外形，保护细胞免受机械损伤或渗透压破坏。细胞膜厚度较薄(7～10nm)，易受渗透压冲击而破碎。

细胞破碎机理

压缩/撞击破碎

剪切破碎

化学渗透

高压匀浆器由高压泵和匀浆阀组成

细胞经历高速造成的剪切、碰撞和从高压到

低压的突变，从而使细胞壁破裂

微生物和植物细胞大规模处理

影响因素:压力\温度\通过匀浆器阀的次数

操作参数少，损失样品少，间歇处理少量

样品时效果好。

1.高压匀浆法

（High-pressurehomogenization)

（一）机械破碎法

细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等

研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。

影响参数:搅拌转速、细胞悬浮液浓度、循

环速度、玻璃小珠的装量、珠体的直径及温度。

操作简便稳定、破碎率可以控制，易放大，

有实验室规模和工业规模。

适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别适用于

有大量菌丝体的微生物和一些有亚细胞的微生物。

2.珠磨法

(Beadmilling)

（一）机械破碎法

超声波具有频率高、波长短、定向传播等特点，

通常在15~25kHz的频率下操作。

细胞破碎与液体空穴作用引起的冲击波和剪切力

有关。超声波在水中传播，产生能释放巨大能量的

激化和突发，即空穴作用。

缺点：产生大量热，不易驱散，不适于大规模工

业应用。生物大分子如核酸和酶对超声敏感。不宜采用

适用于大多数微生物细胞破碎

3.超声波法

(Ultrasanication)

（一）机械破碎法

利用酶反应分解、破坏细胞壁上特殊的化学键而达到破壁的目的。

优点：生物特异性，温和的操作条件、低能耗，能选择性释放产物，

可以避免不利的物理条件。

常用的溶酶有：溶菌酶（Lysoryme）、蛋白酶、糖苷酶、3-葡萄糖酶等，

其中溶菌酶是商业上唯一大规模应用的细菌溶酶。

自溶作用是酶溶的另一种方式。通过调节温度、pH或添加有机溶剂等

激活剂，诱导细胞产生溶解自身酶的方法。

1.酶解法

(Enzymolysis)

（二）非机械破碎法

常用溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等，细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。

溶菌酶主要用于细菌，其他酶对酵母作用较显著。

细胞工程中，酶溶法大量用来剥离细胞壁，将原生质体进行融合。破坏植物细胞壁常用纤维素酶（cellulase）。

外加酶法主要用于实验室规模，如利用酶溶法可从细胞内不同位置选择性地释放目的产物(如克隆的胞内蛋白质)。

外加酶法

酶解法

通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。

微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法。

自溶法在一定程度上能用于生产。缺点是对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性；自溶后细胞悬浮液粘度增大，不利于过滤分离。酵母在45－50℃下保温20h左右，可发生自溶。

对谷氨酸生产菌，可加入0.028mol/LNa2CO3和0.018mol/LNaHCO3，配成pH10缓冲液，再配3％细胞悬浮液，加热至70℃，保温20min，菌体即自溶。

自溶法(Autolysis)

酶解法

将细胞放到高渗介质中（甘油或蔗糖溶液），细胞收缩，平衡后将介质

快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压突然变化，胞外水迅速

渗入细胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。

优点：条件温和，选择性高、