1细胞基本操作.docx

一、细胞冻存（慢冻）

细胞在培养基中，培养至对数生长期

预先配置好冻存液：含20%血清培养基+10%DMSO+70%培养基（避免临时配置产热伤害细胞）

取对数生长期细胞，吸弃培养液

PBS润洗1-2次（放置培养基降低胰酶的消化能力）

消化1-2min，至细胞不再贴壁，轻轻敲击培养皿，震落细胞

加入适量冻存液，终止消化

枪头吹打细胞悬液（106-5×106）至均匀

加入1ml细胞于冻存管中，标记：细胞名称/冷冻时间/操作者等信息

9. 程序性降温：4℃10min，-20℃30min；-80℃16-18h,液氮槽中长期存储二、细胞复苏（快融）

提前准备好水浴锅，水浴加热

液氮中取出冷冻管，迅速投入至37-38℃水浴锅，使其在1min快速融化

温育PBS/血清/抗生素等，37℃10-20min

配制10%胎牛血清(1ml)+90%DMEM培养基（9ml）于培养皿中进行

打开冻存管，小心倾倒至培养皿内，呈倒8字摇晃至均匀

倒置显微镜观察细胞生长状况，细胞未贴壁。

6-8h后，细胞贴壁，更换细胞培养基（去除冻存时DMSO）

另一种方法：复融后，加入10倍体积的培养液，1200r/min，4min离心去除DMSO，再加入培养基，培养细胞

三、细胞传代

1.37℃温育DMEM/血清/PBS等，10-20min

倒置显微镜观察细胞状态（是否长满？）

真空泵吸弃培养基，加入1mlPBS润洗细胞（清除DMEM，否则浪费胰酶）

加入1ml胰酶消化2-3min,CO2培养箱37℃

加入培养基终止消化，移液枪吹打至均匀（轻柔，否则细胞容易损伤）

按照需要传代（2-4皿），控制细胞密度不要太大，否则很容易又长满了。多余的可以真空泵吸弃

培养箱培养。一般2天换液

四、细胞换液

1、观察细胞状态，培养基颜色。吸弃原有培养基

2.加入9mlDMEM+1ml胎牛血清（后加血清，转圈圈式轻柔加入，均匀不伤害细胞）3.呈倒8字，混匀培养基即可

五、细胞铺板

（简易版）

吸弃培养基

PBS清洗2-3次，胰酶消化2-3min，DMEM，终止消化

收集消化后的细胞，加入1ml胰酶和4mlDMEM至离心管内。960r/mln,6min,封口膜封口

配置10倍稀释液（630ulPBS+70ul细胞液）1ml离心管。（稀释10倍）

吸弃OR倾倒离心后的培养基，重新加入5ml/10ml培养基，枪头反复吹打至细胞混匀

混匀后，吸70ul细胞液和PBS混和，吹打至均匀

细胞计数板细胞计数。计算细胞数量和密度

提前撰写好实验方案，根据现有细胞密度和实验所需细胞密度，进行调整。

总体积18ml同时计算好实验用血清/孔板/DMEM等情况，例如：

总体积18ml

血清1.8ml细胞原液1.8ml细胞原液180ul实验所需细胞密度×铺板总体积/细胞原液密度（总液）1个6

血清1.8ml

细胞原液1.8ml

细胞原液180ul

实验所需细胞密

度×铺板总体积

/细胞原液密度

（总液）

铺板所需细胞总数所需细胞密度2×104

铺板所需细胞总数

进行铺板。

六、细胞计数板计数

1.将血球计数板及盖玻片擦拭干净，盖片盖在计数板上

2.10μ或者200μ枪（小刻度）吸出少量细胞悬液，滴加在盖玻片边缘，使细胞悬液充满在盖玻片和细胞计数板之间

静止3min

倒置显微镜下进行细胞计数（就是4个角上的4个大格子=4×16小格），4个大格子的细胞数除以4得每个大格子的（每个角）平均细胞数

细胞/ml=4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数（一般为10倍）

计数方法，数左不数右数上不数下，呈弓字型数。抱团细胞计1个细胞，超过10%细胞抱团，需要重悬细胞。

七、海院酶标仪使用方法

1.开机：密码1234

选择模板号，1号（MTT），建微板

放置96孔板，打开上盖

读出/取导出Excel,另存为

注：电脑上U盘勿动，为右侧显微镜的驱动装置七、细胞实验中的注意事项

取细胞实验无尘服，手套喷洒酒精

实验所需物品（枪头/离心管/等），从旁边的消毒柜取出，喷洒70-90%酒精，放置在超净工作台，紫外灯打开灭菌30min

实验开始前，温育培养基/胎牛血清等至37℃水浴

紫外照明结束后，打开工作台鼓风和照明，喷洒酒精擦拭台面

真空泵的使用（吸弃培养基）：储液瓶内最初加入5-10ml 84消毒液，废液勿超过1/2,以免染菌。真空泵不锈钢针头，酒精灯外延灼烧灭菌5．分装或者加液时，两个器皿之间勿接触，且需要酒精灯外焰灼烧瓶口，悬空不接触进行倾倒。

所有枪最好不