基因克隆的载体.ppt

对这8个阳性克隆进行进一步的Southern分析，表明6个片断带有长度为2.2kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中1.2kb的片断编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序列分析表明与高等植物的同原性在92%，与蓝色细菌同源性75%第63页,共86页，2024年2月25日，星期天1.6.4pUC质粒载体人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。第64页,共86页，2024年2月25日，星期天一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：

1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；

2、氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。

3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。第65页,共86页，2024年2月25日，星期天AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites, 多科隆位点）LacpromoterlacZ’第66页,共86页，2024年2月25日，星期天pUC质粒载体的形体图第67页,共86页，2024年2月25日，星期天pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;

仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500～700个拷贝。第68页,共86页，2024年2月25日，星期天第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三，具有多克隆位点MCS区段．方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。第69页,共86页，2024年2月25日，星期天1.6.5其它的重要的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体第70页,共86页，2024年2月25日，星期天（1）丧失迁移功能的质粒载体

第一,拥有较高水平的拷贝数,平均每个大肠杆菌寄主细胞可达30～45份;第二,失去了bom位点，即便在共存的F质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。第71页,共86页，2024年2月25日，星期天第72页,共86页，2024年2月25日，星期天（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体pGEM-3Z是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体，总长度2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ’基因。pGEM-3Z与pUC质粒之间的主要区别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异的识别位点。第73页,共86页，2024年2月25日，星期天第74页,共86页，2024年2月25日，星期天pGEM-11第75页,共86页，2024年2月25日，星期天现在以发展出了一大批在多克隆位点区附近参入噬菌体RNA聚合酶启动子的简单的质粒载体，它们都是由pUC系列载体派生而来的。噬菌体的RNA聚合酶，所合成的RNA转录本除了可作为杂交探针之外，在兔网织红细胞裂解物转译体系或在麦胚无细胞转移体系中进行体外蛋白质的合成。在反应混合物中加入m7GpppG，能形成5’的帽子结构，进行有效的蛋白质合成。第76页,共86页，2024年2月25日，星期天第77页,共86页，2024年2月25日，星期天（3）穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。第78页,共86页，2024年2月25日，星期天早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。第79页,共86页，2024年2月25日，星期天第80页,共86页，2024年2月25日，星期天1.6.5质粒载