apoB多态性检测的方法(包括VNTR-Eco和MSP酶切多态性).ppt

apoB基因多态性分析apoB基因独立位于2号染色体短臂末端（2p23），单拷贝。基因全长43kb，含28个内含子和29个外显子。功能：载脂蛋白B（apoB）是VLDL、IDL和LDL的主要结构蛋白,其主要功能是转运内源性胆固醇,维持体内血胆固醇平衡。apoB基因在所有载脂蛋白基因中具有最明显的多态性，其核苷酸变异有75处，其中导致氨基酸变异的有54处。一、apoB-VNTR3’VNTR位于该基因3’端下游第2个PolyA信号以下位置的一个可变数目串连重复序列，也称小卫星区（minisatellite）。根据重复序列长度的不同，可分为不同的等位基因型，自从1989年首先发现14种ApoB基因3’VNTR等位基因以来，国内外至今已发现22种等位基因，长度在400～1200bp之间，根据重复序列的内部结构可以把这些重复序列分为两类：一类是ATAATTAAATATTTT，称为X型；另一类是ATAATTAAAATATTT，称为Y型。其序列中发生单核苷酸取代（即G或C取代T），又可产生X或Y的变异体Xi、Yi、Xii和Yii等。VNTR重复序列数目的不同，以及每一重复序列内部结构的变化决定了VNTR的高度多态性。有关3’VNTR多态性PCR-VNTR(VariablenumbleoftandemlyrepeatedshortDNAsequence)多态性检测PCR；电泳检测有关PCR反应PCR反应体系PCR过程PCR的基本原理标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200μmol/L引物各10～100pmolTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L模板DNA0.1～2μgapoB-VNTRPCR反应引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5μl总体积：30μl（1）PCR反应体系（2）PCR程序94℃?5min（预变性）94℃?60’’（变性）60℃?4min（复性+延伸）60℃?5min（续延伸）4℃保存30cycle二、酶切位点多态性1.EcoRI酶切位点apoB基因的EcoRI酶切位点多态性是由于4154位密码子突变，使原有的EcoRI酶切位点消失，产生E-等位基因，并使所编码的谷氨酸被赖氨酸取代。有研究认为具有突变的E-等位基因与血浆高胆固醇（TC）及高低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平有关，与血浆甘油三酯(TG)、LDL-C水平升高相关。GAATTCCTTAAGEcoRI酶切位点多态性检测

PCR反应引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5μl总体积：30μl（1）PCR反应体系（2）PCR程序94℃?5min（预变性）94℃?1min（变性）58℃?3min（复性+延伸）72℃?5min（续延伸）4℃保存30cycle酶切反应及电泳检测(1)酶切反应体系：PCR反应产物10ul10XbufferEcoRI2ul双蒸水18ulEcoRI1ul(2)酶切反应时间：37℃12小时，最后65℃20min终止反应。(3)电泳检测2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果：EcoRI酶切位点出现E+E+(含253bp、227bp2条带)、E+E-(含480bp、253bp、227bp3条带)和E-E-(含480bp1条带)3种基因型。E-E-E-E+E+E+2.MspI酶切位点多态性对个体血脂影响不大，但由于它在CHD人群中出现频率较高，推测它与脂质代谢、CHD发病之间存在某种联系CCGGGGCCMspII酶切位点多态性检测

PCR反应引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5μl总体积：30μl（1）PCR反应体系（2