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光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较
(一)、透射电显微镜
1、基本原理
在光学显微镜下无法看清小于0.2µm的细微结构,这些结构称为亚显微结构
(submicroscopicstructures)或超微结构(ultramicroscopicstructures;
ultrastructures)。要想看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜的分
辨率。1932年Ruska发明了以电束为光源的透射电显微镜(transmissionelectron
microscope,TEM),电束的波长要比可见光和紫外光短得多,并且电束的波长与发射
电束的电压平方根成反比,也就是说电压越高波长越短。
目前TEM的分辨力可达0.2nm。电显微镜(图2-12)与光学显微镜的成像原理基本一
样,所不同的是前者用电束作光源,用电磁场作透镜。另外,由于电束的穿透力很弱,
因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机
(ultramicrotome)制作。电显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电照明系统、电
磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。
表2-2不同光源的波长
电束
名称可见光紫外光射线α射线
0.1Kv10Kv
波长(nm)390~76013~3900.05~130.005~10.1230.0122
扫描电显微镜(scanningelectronmicroscope,SEM)于20世纪60年代问世,用来
观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电束扫描样品,在样品表面激发出次级
电,次级电的多少与电束入射角有关,也就是说与样品的表面结构有关,次级电由
探测体收集,并在那里被闪烁器转变为光信号,再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控
制荧光屏上电束的强度,显示出与电束同步的扫描图像。图像为立体形象,反映了标
本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电,标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金
属微粒,重金属在电束的轰击下发出次级电信号。
目前扫描电镜(SEM)的分辨力为6~10nm,人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的光点,
则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000。
电显微镜技术
目前,电显微镜技术(electronmicroscopy)已成为研究机体微细结构的重要手段。常
用的有透射电镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)和扫描电显微镜(scanning
electronmicroscope,SEM)。与光镜相比电镜用电束代替了可见光,用电磁透镜代替了光
学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电束成像。
成像原理
1、透射电镜技术(TEM)
透射电镜是以电束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像,投射到荧光屏上或照相
底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.1~0.2nm,放大倍数为几万~几十万倍。由于电
易散射或被物体吸收,故穿透力低,必须制备更薄的超薄切片(通常为50~100nm)。其制备
过程与石蜡切片相似,但要求极严格。要在机体死亡后的数分钟钓取材,组织块要小(1立方
毫米以内),常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋,用特制的超薄切片机
(ultramicrotome)切成超薄切片,再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电染色。
电束投射到样品时,可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电发射,如电束
投射到质量大的结构时,电被散射的多,因此投射到荧光屏上的电少而呈暗像,电
照片上则呈黑色。称电密度高(electronense)。反之,则称为电密度低(electron
lucent)。
2、扫描电镜术
扫描电镜是用极细的电束在样品表面扫描,将产生的二次电用特制的探测器收集,
形成电信号运送到显像管,在荧光屏上显示物体。(细胞、组织)表面的立体构像,可摄制成
照片。
扫描电镜样品用戊二醛和饿酸等固定,经脱水和临界点干燥后,再于样品表面
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