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专业整理分享
【一、提RNA】
一、实验准备:
1、试剂:75%乙醇、Trizol、1.5mL进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、
2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇),放-20℃冰箱预冷;
3、预冷离心机(1.5mLEP管用的);
4、清洁桌面,酒精喷过之后擦干,新手套、两层口罩;二、操作步骤:
01、弃上清(不回收,直接倒去);
02、1mL/孔PBS洗两遍(不回收,直接倒去,随后用200μL枪吸尽PBS);
03、每孔加500μLTrizol,轻晃,随后室温放置2min左右;
04、枪头吹打,吸出放入1.5mL进口EP管;
05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol);
06、4℃离心机,12000g,15min;
07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL进口EP管中(注意:只能吸到上清);
08、加入等体积异丙醇,充分混匀,常温放置10-30min(15min);
09、4℃离心机,12000g,10min;
10、倒掉液体,加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀;
11、4℃离心机,7500g,5min;
12、倒掉上清,加入1mL预冷的75%乙醇,混匀;
13、4℃离心机,7500g,5min;
14、倒掉上清,倒扣在餐巾纸上,5-10min,用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠;
15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水,吹打溶解;
16、测浓度(先知楼21楼测RNA浓度,带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头);三、注意事项
01、如果当时不测RNA浓度,可暂时把RNA放在-20℃冰箱。但长时间(24h)保存,需要放在-80℃冰箱;
02、异丙醇作用是沉淀RNA,作用比乙醇好;
03、
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09、
完美DOC格式
【二、测RNA浓度】
一、实验准备:
专业整理分享
01、先知楼21楼-2109教室,一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌ddH
2
O、10μL枪头(RNA
专用)、本子+笔;二、操作步骤:01、登记;
02、打开电脑==打开“N”软件==点击“Nucleicacid”==选择“OK”==选择“RNA”;
03、灭菌ddH
2
O清洗2-3遍,擦干;
04、DEPC水校零:即加DEPC水一滴,点击“Blank”,擦干;
05、测RNA:加样品一滴,点击“measure”,擦干,随后加下一个样品;
06、记录数据,包括RNA浓度(1000ng/μL)、260/280;
07、灭菌ddH
2
O清洗2-3遍,擦干;
08、-80℃冰箱保存;三、注意事项
230nm代表有机物水平(碳水化合物),260nm代表RNA水平,280nm代表蛋白水平,
260/230表示有机物量,260/280代表RNA提取量;
A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为0.1-1.0。如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素(如移液不准确,样品内有悬浮物等)影响。DNA样品的A260吸光度值是否0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值0.1);
A280nm、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8,纯RNA为2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中,需要降低样品的稀释度,A230的负值会被校正。
A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。纯样品的A320一般是0。
A260/A280和A260/A230是核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA,在pH7-8.5下A260/A280的比值应该在2.0或2.5。纯净的样品比值大于
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