2023年高中生物竞赛课件79细胞形态结构的观察方法.pptx

细胞形态结构的观察方法;一、光学显微镜;第一节细胞形态结构的观察方法;一、光学显微镜(lightmicroscope);（一）普通复式光学显微镜——组成;（一）普通复式光学显微镜——分辨率;（一）普通复式光学显微镜——分辨率;AlbertsB,HopkinK,JohnsonAD,etal.EssentialCellBiology.5thed.NewYork:GarlandPublishingInc.,2018;（一）普通复式光学显微镜;（一）普通复式光学显微镜——样品制备;（一）普通复式光学显微镜;（二）相差显微镜和微分干涉显微镜;相差显微镜：利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察

A.两束光的相位相同→相互干涉的结果使光波的振幅↑，亮度↑

B.两束光的相位相反→光波的振幅↓，亮度↓;相差显微镜在普通光学显微镜的基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差;第一台相差显微镜：1932年,德国物理学家P.Zernike,1953年获诺贝尔物理学奖

1952年,G.Nomarski发明微分干涉显微镜(differantial-interferencemicroscope)，又称Nomarski相差显微镜

;微分干涉显微镜：以平面偏振光为光源，光线经过棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，再经另一棱镜将两束光汇合，从而使样品中厚度上的微小区别转化为明暗区别（更适于研究活细胞）

分辨率：比普通光镜提高一倍

结合高分辨率录像装置制备的录像增差显微镜（Video-enhancemicroscope)可用于直接观察颗粒物质沿微观运输的动态过程;明场;（三）荧光显微镜——基本原理;;激发光源;（三）荧光显微镜——基本原理;滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成

激发光片：光源和样品之间，只允许特定波长的激发光通过；

阻断滤光片：物镜和目镜之间，只允许荧光染料所发出的荧光通过；;免疫荧光技术

荧光素直接标记技术(DAPI)

绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达;;优点：

检出能力高

对细胞的刺激小

能进行多重染色

用途：

物体构造的观察

荧光的有无、色调比较进行物质判别

荧光量的测定对物质定性、定量分析;GFP和叶绿体自发荧光由488nm激发光所激发,荧光采集波长分别为500~530nm(GFP)和650~750nm(叶绿体荧光;荧光显微镜(a)和激光扫描共焦显微镜(b);（四）激光扫描共焦显微镜;优点：成像清晰，可通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构。改变焦点可获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构样品的三维结构;荧光显微镜(a)和激光扫描共焦显微镜(b);（五）超高分辨率显微术;（五）超高分辨率显微术;1、全内反射荧光显微术(TIRFM);2、基于单分子成像技术的PALM/STORM方法;原理：

目的蛋白克隆到PA-GFP表达载体，转染细胞，融合蛋白表达

用405nm激光照射细胞，随机使很少一部分(相隔较远)PA-GFP激活

488nm激光激发激活的PA-GFP发出绿色荧光，高斯函数拟合定位荧光分子

用488nm激光将已精确定位的荧光分子漂白，使其不能在下一轮激光照射时被激活

重复，每次都用405nm和488nm激光激活、激发、定位和漂白少量荧光分子，直至将细胞内几乎所有荧光分子都精确定位，将所得到的图像合成在一张图上;优点：分辨率比传统光学显微术提高10倍

缺点：只能用于观察外源表达蛋白的定位，且每一幅图像照相所需时间长，不适合用于活细胞动态观察

;发明人：庄小威

应用：细胞内源性蛋白的超分辨率定位

原理：花青染料可被一种波长的光激活发出荧光，还可被另一种波长的光波关闭而处于暗态，可用不同波长的光波照射这些花青染料以控制其发光或不发光;例：

成对的染料Cy3/Cy5标记靠的很紧的蛋白

显微镜下先用激光使报告分子Cy5失活

用561nm激光随机的激活少数几个Cy3，并导致与其配对的Cy5活化

用647nm激光激发Cy5，使其发出670nm的荧光，相机捕捉信号，高斯拟合求出其中心位置

重复→重构内源蛋白分布的高分辨率图像

缺点：耗时，活细胞中难实现;3、4π和STED显微术;2）受激发射损耗显微术

(Stimulatedemissiondepletion,STED);原理：通过光栅的旋转和移动将多重相互衍射的光束照射到样本上，并在此发生干涉，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨信息，生成一副完整图像

分辨率：x,y轴达到100nm，z轴提高2倍，但分辨率远低于其他超分辨率显微术

优点：普通的免疫荧光标记样本和各种荧光蛋白表达样本可不经特殊处理直接观察;第一节细