鸡大肠杆菌油佐剂菌苗的制备.ppt

鸡大肠杆菌油佐剂菌苗的制备

实训目的了解油佐剂菌苗的制备过程及操作、使用注意事项。实验材料恒温水浴振荡器、恒温培养箱、离心机、乳化机、平皿、试管、接种环等。大肠杆菌菌种、普通肉汤培养基、司盘80、96份10号白油、甲醛、雏鸡。

操作步骤菌种增殖：将分离所得大肠杆菌菌株接种于普通肉汤试管中，置37℃培养16-18h，然后划线接种于普通琼脂平板上，经37℃培养18?-?24?h，选取光滑圆整菌落，接种于普通琼脂斜面，37℃培养18?-?24?h，再分别接种于普通肉汤中，置于气浴恒温振荡器37℃培养16?~?18?h，置2-8℃贮藏备用。

操作步骤纯粹检验：菌液培养完成后，取样用普通琼脂作纯粹检验，每瓶样品需检验。吸取适量液体移至营养肉汤和营养琼脂斜面各1支，继续37?℃培养7?d,若均无杂菌生长，判定合格。活菌计数：将收获的菌液按常规方法计数，检查菌数应不少于1?x?1010cfu?/毫升。

操作步骤灭?活：将满足上述浓度的大肠杆菌悬液，在经-20℃冻溶3次后加入甲醛溶液，使其终浓度为0.8%，封口并混匀置37℃保温杀菌48?h（中间振荡8次），然后作无菌检验。无菌检验：取灭活好的菌液，接种营养琼脂平板和血琼脂平板，同时接种厌气肉肝汤，37℃培养24-48?h，未见有细菌生长则判为合格。

操作步骤菌苗制备：1.油相制备：取4份司盘80和96份10号白油混匀，高压灭菌备用。2.水相制备：将配好的菌液加入4%的灭菌吐温80并充分溶解。

操作步骤菌苗制备：3.乳化制苗：将油相与水相按一定比例混合，置乳化机中高速搅拌3~5?min，快速乳化成油包水状，分装备检。物理性状检查菌悬液静置后下层有少许沉淀，上层为黄褐色半透明液体，摇动后沉淀能悬浮，呈均质淡黄褐色混悬液。

操作步骤安全检验：用1周龄、3周龄健康易感雏鸡10只，每只颈背皮下或胸部肌肉注射油佐剂菌苗2份，观察14?d，若鸡不发病，则菌苗安全。

操作步骤效力试验：用1周龄、3周龄健康、未感染、未接种相应菌苗的易感雏鸡10只，每只颈背皮下或胸部肌肉注射菌苗0.5ml，免疫14d后，连同另10只未免疫对照鸡每只肌肉注射A、B、C、D菌株混合强毒菌液0.2?mL?（含5.0?×?108?cfu），继续观察10~14d后，对照组动物应按预定发病及死亡，而疫苗免疫动物应健活。

注意事项分离细菌要严格无菌操作，避免污染。细菌灭活要彻底,无菌检验很关键。水相制备时要与Tween-80混合均匀。乳化时注意将油相冷却后在乳化，防止油温过高使抗原性降低。

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