核酸的提取课件.pptVIP

*RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)*经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏、维持核酸结构的稳定等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组DNA的首选。高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首选。含CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组DNA抽提的首选裂解方法。SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组DNA污染的特点。机械方法化学试剂法反复冻融法酶解法*裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。*因动物组织含有核酸酶，在一定温度下，该酶可被Ca2+,Mg2+等激活，为避免核酸酶对核酸的水解，与核酸提取液中加入适量螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），除去这些离子，整个过程在低温下进行。*①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。用蛋白质变性剂或水解使RNA与蛋白质分离，故加入蛋白质变性剂如氯仿、异戊醇、SDS、热酸等，使蛋白质变性沉淀，从而核酸和蛋白质分离，经离心后溶液分为三层：上中下分别是核酸溶液、变性蛋白质凝胶和氯仿针对不同的用途，选择不同的纯化方法，任何一种方法他都有其优缺点，在试验中，没有错误的方法，只是选择的方法不正确。*酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。(1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。*①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。*⒋纯化RNA核酸不溶于乙醇等有机溶剂，加2倍体积95%冰乙醇沉淀RNA，使其与其他杂质分开，再加1mL0.10mol/LNaOH溶解RNA，得到纯化的RNA提取液沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。。原理是：*⒋纯化RNA核酸不溶于乙醇等有机溶剂，加2倍体积95%冰乙醇沉淀RNA，使其与其他杂质分开，再加1mL0.10mol/LNaOH溶解RNA，得到纯化的RNA