等电焦集法完整版.ppt

蛋白质电泳检测;电泳原理;以电泳确定蛋白质的分子量;;;电泳的种类;其它電泳技術;;聚丙烯醯胺膠体電泳：;SDS;;PAGE

電泳膠体系統的各組成部份;a.單体分子(monomer)

丙烯醯胺(acrylamide)，H2C=CH-CO-NH2。

b.架橋分子(bridge)

Bis[N,N-methylene-bis(acrylamide)]可看作兩個丙烯醯胺單体分子連結在一起，可形成分叉點，以構成立体結構。

c.游基(freeradical)產生者

通常使用過硫酸銨(ammoniumpersulfate,APS)或者riboflavin(即維生素B2)。

d.催化劑

TEMED(tetramethylethylenediamine)幫助游基電子的傳遞。

;胶体聚合反應;;;直立式柱狀電泳;SDS－PAGE分离蛋白质;梯度電泳系統;;上述組成電泳的五個部分中，只有膠体的緩衝液含氯離子；而樣本溶液中則含有glycine，沒有氯子。

樣本溶液-焦集膠体-分離膠体三段的pH是不連續性的，其pH分別為8.3-6.9-8.9，而glycine的pI恰為6.9

電泳一開始glycine進入焦集膠体，立刻變成不帶電的的分子(白點)，泳動率變小；同時氯離子則很快的往正極泳動，因此在氯離子與glycine之間有一段缺乏離子的空間，電壓變得很高

?;;;;;染色及乾燥;Disc與SDS的比較;;;;;电泳結果不佳分析;;d.色帶扭曲

染出的色帶形狀扭曲(如波浪狀)，可能是蛋白質溶解度不好，或樣本中含太高的鹽類。凝膠不均勻時，也會有色帶扭曲的現象，可能是APS沒有溶解完全。

e.樣本干擾物質

色帶擴散太過，有嚴重拖尾現象，或左右拉寬，可能是樣本液的pH不對(一般是過酸)，或者樣本中的鹽濃度太高。

f.?溫度不均

膠片左右兩邊泳動的速度不一時，請檢查跑得慢的那個方向，有無冷氣或風扇吹來，降低一邊膠片的溫度。

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