质粒提取有关问题及注意点.pdf

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质粒提取常见问题解析

涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死.

参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧

的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，

应用几个涂布棒免得穿插污染。

原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常

参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比拟特殊的序列中。解决方法：

1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更

加稳定。

3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意

一下！

【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：

1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略

带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比

或者没有气味，可以和正常菌液对照。

2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进展划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，

第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左

右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话根本

上不正常了。】

未提出质粒或质粒得率较低，如何解决.

参考见解：

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1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进展液体培养。

2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有一样功

能的高拷贝数载体。

3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在*些菌种中稳定存在，经屡次转接后有可能造成质粒

丧失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接

种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加

溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质

粒提取量和提高质粒质量。

5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解

为清亮的溶液，才能使用。

6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分屡次

提取。假设用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；假设质粒是非常高的拷

贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。

7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再参加洗脱缓冲液。

9、洗脱液参加位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜

的外表到达最大洗脱效率。

10、洗脱液不适宜：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mMTris-HCl,

1mMEDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当

水洗脱时确保其pH值在此围，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗

脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。

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11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产

品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可到达较好的效

果。

细菌离心参加溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状.

参考见解：

1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前PBS将菌落

洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。

2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活