一次性使用卫生用品中绿脓杆菌检验 实时荧光PCR法.pdf

一次性使用卫生用品中绿脓杆菌检验实时荧光PCR法

1范围

本文件规定了一次性使用卫生用品中绿脓杆菌的实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于一次性使用卫生用品中绿脓杆菌的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法

GB15979一次性使用卫生用品卫生标准

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1一次性一次性使用卫生用品

使用一次后即丢弃的、与人体直接或间接接触的、并为达到人体生理卫生或卫生保健（抗菌或抑菌）

目的而使用的各种日常生活用品，产品形状可以是固体或液体。例如，一次性使用手套或指套（不包括

医用手套或指套）、纸巾、湿巾、卫生湿巾、电话膜、帽子、口罩、妇女经期卫生用品（包括卫生护

垫）、尿布等排泄物卫生用品（不包括厕所用纸）等。

3.2DNA(deoxyribonuleicacid)：脱氧核糖核酸

3.3eta(exotoxinAgene)：胞外毒素编码基因

3.4PCR(polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应

3.5Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数

4原理

一次性使用卫生用品样品经扩增培养后，提取增菌液中DNA，以提取的DNA为模板，以绿脓杆菌

中（eta）基因中相对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧光PCR扩增，根据Ct值判断样品

中是否含有绿脓杆菌。

5试剂和材料

试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T27403的规定执行。

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA

酶污染的容器分装。

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5.1试剂

5.1.1SCDLP液体培养基：见附录A.1。

5.1.2PCR扩增引物序列：见附录B.1。

5.1.3荧光探针序列见附录B.1。

5.1.42X荧光定量PCR预混液。

5.1.5商品化DNA抽提试剂盒。

5.1.6绿脓杆菌标准菌株：来源自国家认可的菌种保藏机构。

5.2耗材

5.2.1离心管：200μL、1.5mL、5mL、10mL。

5.2.2PCR反应管：单管、八联管或96孔PCR微孔板。

6仪器和设备

6.1分析天平：感量0.01g。

6.2微量可调移液器：单道:1~10μL、10~100μL、100~1000μL。

6.3恒温水浴锅。

6.4涡旋仪。

6.5冷冻高速离心机。

6.6高压灭菌锅。

6.7超净工作台。

6.8二级生物安全柜。

6.9实时荧光定量PCR仪。

6.10恒温培养箱：35±1℃。

6.11核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.12冰箱：4℃，-20℃。

7实验操作步骤

7.1取样

在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装，从每个包装中取样，准确称取10±1g

样品。剪碎后加入200mL无菌生理盐水中，充分混匀。液体产品直接用原液作为样液。

7.2增菌

取样液（7.1）5mL，加入到50mLSCDLP培养液中，充分混匀，置于35℃±1℃培养箱中培养18h。

7.3模板DNA的提取与制备

7.3.1手动提取法：从样品增菌液（7.2）表层吸取1mL增菌液。离心收集细菌（4000rpm/min，

10min），去上清液。加入600μL核酸裂解液，重悬菌液。100℃水浴5min后冷却至室温。12000rpm/min

离心3min，将上清液移至干净的1.5mL离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，置于4℃冰箱静置1h，12000

rpm/min离心2min，去上清液。加入200μL70%乙醇轻柔倒置洗涤2~3次，12000rpm/min离心2min去

上清液，风干10~15min，加入100μL无菌双蒸水重悬后于4℃保存，