绿孔雀人工繁育中亲本配对选择技术规程--标准草案.docx

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绿孔雀人工繁育中亲本配对选择技术规程

1范围

本文件规定了绿孔雀（Pavomuticus）人工繁育过程中亲本配对选择中避免近亲繁殖的物理标识和生物信息鉴定技术。

本文件适用于绿孔雀人工繁育。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489-2004实验室生物安全通用要求

GB/T35892-2018实验动物福利伦理审查指南

GB/T37864-2019生物样本库质量和能力通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

人工繁育artificiallypropagated

经管理部门批准,依法从事野生动物饲养管理的活动。3.2

近亲繁殖inbreeding

三代以内近亲间的交配繁殖。3.3

基因组genome

生物体所有遗传信息的总和，真核生物中这种遗传信息以DNA分子形式存储。3.4

参考基因组序列referencegenomesequence

通过对某个物种的基因组进行从头测序，利用生物信息学分析方法进行拼接、组装，而获得的基因组序列信息。

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3.5

基因组重测序genomeresequencing

针对有参考基因组序列的物种的不同个体进行基因组测序，以获取个体或群体间的差异性信息。

4物理标识

4.1标识对象

用于人工繁育的亲本、所产之卵、孵化幼体、成体后代。

4.2标识材料

卵壳标记使用记号笔。成体及幼体使用脚环标记，材料应经久耐用，不易脱落，易于辨识和编码。幼体约3月龄更换成体脚环。

4.3编码与档案管理

对标识进行统一编码。建立物种谱系和繁育档案，记录内容详见附录A。

5分子鉴定

5.1鉴定个体

无法通过物理标识判定亲缘关系的绿孔雀个体。

5.2分子鉴定原理

血缘关系越近，两个体间的DNA相似性越高。可通过统计待检样品基因组间的相似性判断其亲缘关系情况。

5.3样品采集与保藏

5.3.1样品采集过程应遵守GB/T35892-2018的要求。

5.3.2操作人身穿防护服，先对翅缘静脉处消毒，使用一次性真空采血管（添加EDTA-K2）采集50μL～100μL血样，并用酒精棉球按压止血。

5.3.3对血样编号，记录采集时间、地点、个体标识号。依据GB/T37864-2019的要求保藏样品。

5.4基因组DNA制备

5.4.1实验室符合GB19489-2004中生物安全通用要求。

5.4.2提取DNA的方法可灵活选择，只要DNA质量符合建库需求的都可用于本标准。要求DNA在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（OD260/280）在1.8～2.0之间，浓度不低于

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50ng/ul，总质量不低于3ug（见附录B.1）。琼脂糖凝胶电泳检测主带清晰，且在2Kbp以上（见附录B.2）。

5.5基因组测序

制备的DNA宜送至具备高通量测序资质的商业公司开展基因组重测序。为保证分析质量，每待检个体总测序原始数据量不低于10Gbp。

5.6参考基因组选择

选择已发布最新版本的纯种绿孔雀基因组作为参考基因组。

5.7变异数据提取

将基因组重测序数据映射到参考基因组，识别和提取个体变异信息，保留高质量位点后续分析（参考质控方案见附录C）。

5.8亲缘关系鉴定

可采用开源软件VCFTOOLS中的KING算法（‘-relatedness2’）计算待检个体基因组间的亲缘系数(φ)。当φ0.0442，判定待检个体间为三代以内的近缘关系。

6亲本配对选择

选择具有三代以外谱系关系的个体开展配对繁殖。

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附录A（资料性）

绿孔雀谱系和繁育档案样表

个体标

来源

父本标

母本标

出生

出生笼

性

同巢个

同巢个

…

识号

识号

识号

时间

舍号

别

体1

体2

□野外□繁育

□雌□雄

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附录B（资料性）

DNA完整性检测与纯度和浓度测量

B.1DNA完整性胶检测

B.1.1用双蒸水洗净制胶模板和梳子，调节水平，放在制胶平板上，向电泳槽中倒入1XTAE电泳缓冲液，其量以没过电泳槽0.2cm为宜。

B.1.2称取1g琼脂糖与100mL1xTAE缓冲液，加入到配胶用的三角烧瓶内，旋转摇晃均匀。

B.1.3微波炉内加热2.5min，取出后加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液。

B.1.4倒入胶槽，加入梳子，室温下放置30min至凝胶完全凝结，小心向上拔出梳子，将凝胶预浸在电泳槽内，静置2min至加样孔内无气泡。

B.1.5