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实用文档 细胞信号转导途径研究方法 一、 蛋白质表达水平和细胞内定位研究 1、 信号蛋白分子表达水平及分子量检测 : Western blot analysis. 蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经 SDS后 , 分离为不同条 带，其中含有能与特异性抗体 ( 或 McAb)相应的待检测的蛋白质 ( 抗原蛋白 ) ，将 PAGE胶上的蛋白条带转移到 NC膜上此过程称为 blotting ，以利于随后的检测能够的进行，随后 , 将 NC膜与抗血清一起孵育，使第一 抗体与待检的抗原决定簇结合 ( 特异大蛋白条带 ) ，再与酶标的第二抗体 反应 , 即检测样品的待测抗原并可对其定量。 基本流程： 检测示意图： 文案大全 实用文档 2、免疫荧光技术 Immunofluorescence （ IF ） 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理， 先将已知的抗原或抗体 标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子 探针检查细胞或组织内的相应抗原 （或抗体）。在细胞或组织中形成的抗 原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发 光的照射而发出明亮的荧光 （黄绿色或桔红色） ，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定 含量。 采用流式细胞免疫荧光技术（ FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子 的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（ Double IF ），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。 二、 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1、 免疫共沉淀 （ Co- Immunoprecipitation, Co-IP ） 文案大全 实用文档 Co-IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的 “ protein A ”能特异性地结合到免疫球蛋白的 FC片段的现象而开发出 来的方法。目前多用精制的 protein A 预先结合固化在 agarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后， beads 上的 prorein A 就能 吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。 当细胞在非变性条件下被裂解时， 完整细胞内存在的许多蛋白质－ 蛋白质间的相互作用被保留了下来。 如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X在体内结合的蛋白质 Y也能沉淀下来。 进一步进行 Western Blot 和质谱分析。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也 可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用。 2、 GST pull-down assay GSTpull-down assay 是将谷胱甘肽巯基转移酶（ GST）融合蛋白（标 记蛋白或者饵蛋白， GST, His6, Flag, biotin ）作为探针，与溶液 中的特异性搭档蛋白 (test protein 或者 prey 被扑获蛋白 ) 结合，然后 根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀 GST融合蛋白的能力来确定相互作用 的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以 启用 GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。 文案大全 实用文档 示意图： 3、 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统（ Yeast two-hybrid system ）的建立是基于对真核 生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活 因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子 GAL4 在结构上是 组件式的（ modular ），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上 相互独立的结构域 （ domain）构成，其中有 DNA结合功能域（ DNAbinding domain,DNA-BD）和转录激活结构域（ activation domain，DNA-AD）。这 两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被 文案大全 实用文档 分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的 GAL4 转录因子活性，并可激活上游激活序列（ upstream activating sequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 将编码某一蛋白 X的 DNA序列与 DNA结合域 BD的编码序列融合形成 一个杂交体 ( “诱饵” bait) ，将编码另一蛋白 Y 的 DNA序列与 DNA激活 域 AD 的编码序列融合形成另一个杂交体 ( “猎物”或靶蛋白 prey or target protein) ，当两个杂交体共转化酵母细胞 （此酵母细胞含有上游 有 DNA结合位点的报告基因） ，若 X 和 Y 没有相互作用， 则单独不能激活报告