酶工程 教学课件 作者 梁传伟张苏勤 主编 胡本高 主审 第四章.ppt

尚辅网 尚辅网 酶工程 第四章 酶的分离纯化 第一节 细胞破碎 一、机械破碎法 利用机械力的搅拌，剪切、研碎细胞。常用的有高速组织捣碎机(Waring blender)、高压匀浆泵(国外称Manton-Gaulin)、玻璃或Teflon研棒勾浆器(国外称Potter-E1vehem homogeniver)、高速球磨机或直接用研体研磨等。动物组织的细胞器不甚坚固、极易匀浆，一般可将组织剪切成小块，再用匀浆器或高速组织捣碎器将其匀质化。匀浆器一次处理容量约50mL，高速组织捣碎器容量可达500—1000mL左右。高压匀浆泵非常适合于细菌、真菌(如酵母)的破碎，且处理容量大，一次可处理几升悬浮液，一般循环2—3次，足以达到破碎要求。 第一节 细胞破碎 二、超声波法 超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段。经过足够时间的超声波处理，细菌和酵母细胞都能得到很好的破碎。若在细胞悬浮液中加入玻璃珠，时间可更短些，一般线粒体经过125W超声处理5min可全部崩解。超声波破碎一次处理的量较大，超声效果以探头式超声器较水浴式超声器更佳。超声处理的主要问题是超声空间局部过热引起酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。 第一节 细胞破碎 三、渗透压法 渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。 四、化学破碎法 化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。 第一节 细胞破碎 1.有机溶剂处理 常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。 例如，将细胞悬浮在10倍体积的预冷至-20℃的丙酮之中，搅拌均匀，待自然沉降后弃上清液，抽滤得细胞，再用2.5倍体积的-20℃丙酮洗涤，抽干后，把得到的细胞立即放入真空干燥器中，除去残余的丙酮，得到细胞干粉，可长期保存，使用时再用水或缓冲液把胞内酶提取出来。常用的大肠杆菌谷氨酸脱羧酶就是用这种方法获得的。 第一节 细胞破碎 2．表面活性剂处理 表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。 表面活性剂有离于型和非离子型之分，对细胞破碎效果而言，离子型表面活性剂较有效，但由于离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，引起酶变性失活。所以，在酶的提取方面一般不采用离子型表面活性剂。而采用非离子型的特里顿(Triton)、吐温(Tween)等表面活性剂。例如，用特里顿X—100处理诺卡氏菌细胞，从而提取胆甾醇氧化酶，用胆酸盐处理细胞，提取一种膜结合的葡聚糖酶等。处理完后，可采用凝胶层析等方法，将表面活性剂除去，以免影响酶的进一步分离纯化。 表面活性剂处理法对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中均已成功使用。 第一节 细胞破碎 五、生物破碎法 在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。 1.外加酶处理 根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。 革兰氏阳性菌主要依赖其细胞壁中的肽多糖维持其细胞结和形状。溶菌酶能专一地作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键。所溶菌酶常用于革兰氏阳性菌的细胞破碎。对于革兰氏阴性菌，则在加入溶菌酶的同时，还要加入EDTA，才能达到细胞破碎的效果。酵母细胞壁的主要成分是β-l，3-葡聚糖，酵母细胞的破碎需外加一定量的β-葡聚糖酶。而霉菌细胞壁含有几丁质，故此，几丁质酶可用于霉菌的细胞破碎。纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用，作用于植物细胞的细胞壁，而使植物细胞破碎。 由于溶菌酶等上述列举的酶价格较高，而且外加酶本身混入细胞破碎液中成为杂质，故此，外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生产。 第一节 细胞破碎 2.自溶法 将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释出的方法称为自溶法。