细胞凋亡及其调控分子机制创新.ppt

三、流式细胞仪检测 flow cytometer （一）PI 单染 （二） Hoechst33342 / PI双染色 （三）Annexinⅴ/ PI双染色 流式细胞仪 flow cytometer荧光激活细胞分类器 fluorescent activated cell sorter, FACS ?Hoechst33342是双苯并咪唑家族成员，能特异性与DNA螺旋小沟中AT结合。它能被活细胞摄入，也能在摄入后被细胞排出。 活细胞对碘化丙锭（PI），溴化乙锭（EB）有拒染性，当细胞被这些染料着染，提示为晚期凋亡或坏死。 （一） PI 单染  细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。 乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。 坏死细胞中，DNA可染性并不立即下降，甚至反而增加，可能是由于细胞坏死时部分DNA变性，引起更多的可染位点。 原理： 收集细胞 ，PBS洗涤 冷70％乙醇固定12 h以上 离心，PBS洗涤，400目筛网过滤 PI（含RNase）染色 流式细胞仪检测 ? 操作： 判断： 在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。 （检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死） A B PI单染检测细胞周期改变  细胞周期分析 （二） Hoechst33342/PI双染色 染料配制： Hoechst33342：配10 ug/ml, 4℃避光保存。 PI：5 ug/ml, 4℃避光保存。 原理： 凋亡细胞膜在早期是完整的，但细胞膜的通透性已有增加，因此进入早期凋亡细胞的Hoechst比正常细胞多；而EB、PI等不能进入凋亡细胞。 即正常细胞不经固定，对EB、PI是拒染的。而坏死细胞早期就被破坏，能被这些染料染色。 操作： 悬浮细胞＋Hoechst3 3342 ，终浓度1ug/ml, 贴壁细胞消化后，培养液重悬，加Hoechst， 37℃,7-10 min， 离心，洗涤， 加 PI，4℃避光15 min， 400目滤网过滤， 流式细胞仪检测。 结果判断： 在双变量流式细胞仪散点图上 正常细胞 Hoechst (-), PI (-) 凋亡细胞 Hoechst (+), PI (-) 坏死细胞 Hoechst (+), PI (+)? （三）Annexinⅴ/PI双染色 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。 PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏, 可用PI区分。 消化收集细胞，1000 rpm离心 6min，弃上清。 加入1 mL冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，离心，弃上清。 加入1 mL冷的1×binding buffer，轻轻振荡使细胞悬浮，离心，弃上清。 4. 将细胞重悬于200 μL 1×binding buffer。 5. 加入10 μL Annexin ⅴ-FITC 和 5 μL 碘化丙锭（PI），轻轻混匀，室温避光反应15 min。加入300 μL 1×binding buffer，立即上机检测。 6. 流式细胞仪Cell Quest软件分析细胞凋亡和坏死的百分率。每个样本随机分析 10000个细胞。 操作： 检测标准： 早期凋亡细胞： Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (-)； 坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞： Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (+)； 机械性坏死及非特异性染色： Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (+)； 正常细胞：Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (-)； C-myc ASO 200 nmol/L 凋亡结果 坏死结果 亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）. JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电