2013SOD-MDA实验试题.ppt

NBT法测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)活力植物组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定 背景知识 植物在逆境胁迫或衰老过程中发生一系列生理生化变化: 如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调、活性氧的积累等。 生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O2.-)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O21)等。 活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。 植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统： 酶促防御系统: SOD、CAT、POD和APX等 非酶促抗氧化剂: ASA和GSH等 丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。 背景知识 实验目的 实验原理 实验材料与设备 实验步骤 注意事项 结果比较分析 思考题 NBT法测定SOD活力 实验目的 了解胁迫反应的具体机制（膜脂过氧化 抗氧化） 了解抗氧化防护酶的测定方法，掌握NBT法测定SOD活力 实验原理 SOD催化下列反应： 2O2.-+2H+→H2O2+O2 本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。 光 SOD H2O2 核黄素+甲硫氨酸 O2.- + NBT →甲腙（560nm） 光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 SOD酶量与光化还原抑制百分率在一定范围内呈线型关系，一般以引起50％光化还原抑制率的酶量为一个酶活力单位 材料、仪器设备及试剂 植物生理生化实验 p172-173 （一）材料与处理：小麦幼苗（盐处理与否）叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进 样器；4.荧光灯；5.试管数支。 （三）试剂： 0.05 mol/L 磷酸缓冲液PBS（pH7.8） 195 mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液 1.125 mmol/L 氮蓝四唑NBT溶液 100 umol/L EDTA溶液 60 umol/L 核黄素溶液 实验步骤 1. 酶液提取：取1 g材料（CK 盐处理）于预冷的研钵中，加5 ml预冷PBS磷酸缓冲液在冰浴研磨成浆，3000 g(4℃) 离心15 min，上清液即为SOD粗酶液。 2. 显色反应：取5ml试管4支，2支为测定管，另2支为对照管。 反应体系中各试剂的终浓度为130 mmol/L Met，75 μmol/L NBT， 4 μmol/L 核黄素， 100 nmol/L EDTA，按下列次序及量（ml）加入各溶液： 1 CK 2 盐处理 3 4 暗管 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 磷酸缓冲液 2.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 核黄素 0.2 Met溶液 0.2 Met溶液 0.2 Met溶液 0.2 Met溶液 0.2 EDTA液 0.1 EDTA液 0.1 EDTA液 0.1 EDTA液 0.1 酶液 0.1 酶液 0.1 缓冲液 0.1 缓冲液 0.1 NBT溶液 0.2 NB