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Effect of individual MAPK pathways on PRAK activity in intact cells Effects of SB203580 and PD98059 on endogenous PRAK activity LPS、UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描 LPS Control UV 细胞信号分子的三维结构分析 蛋白质三维结构分析对于揭示信号分子的功能的作用 蛋白质与蛋白质相互作用的研究 PH TH SH3 SH2 Kinase Btk SH3 SH2 Kinase Src 蛋白激酶结构域 1、蛋白质结合实验 2、免疫共沉淀实验 2、FRET 和 BRET 与信号分子相互作用蛋白质分子的相互作用 酵母双杂合系统 Identification of MEF2C as a substrate for p38 第一步 附着 第二步激活 第三步 紧密粘附 第四步渗出 EC EC ：趋化因子受体 ：PECAM ：白细胞整合素 ：选择素 ：选择素配体 ：白细胞激活物 ：Ig家族成员 图12.1 白细胞的渗出过程 噬菌体展示技术 报告基因技术 研究细胞信号转导通路通过转录因子对基因启动子转录活性的影响。 0 5 1 0 1 5 Relative luciferase activity Control LPS EGF LPS+FHPI p38 is involved in the enhancement of TNF-? promoter transactivity Induction of c-Jun through MEF2C phosphorylation by p38 蛋白质与核酸相互作用技术 研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。 First Military Medical University 细胞信号转导的技术方法 蛋白激酶磷酸化及其活性测定 蛋白激酶磷酸化的检测 裂解培养的细胞获得裂解上清 以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 SDS再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体 以Phospho Ab-HRP Western 化学发光检测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度。 经典蛋白激酶活性分析实验流程 以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 加入该激酶底物和?32-ATP，激酶使底物磷酸化 放射自显影，确定磷酸化条带 以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 加入该激酶底物，激酶使底物磷酸化 再加入底物磷酸化特异性抗体 以Phospho Ab-HRP Western 化学发光检测试剂盒测定底物的磷酸化程度，进而推出蛋白激酶活性 非放射性蛋白激酶活性分析实验流程 较传统激酶活性测定方法的优点 无需接触放射性物质 敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子 特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性分析 信噪比高 低背景 系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测试酶活的试剂 节约时间：由几天降到几分钟 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 0 5 10 20 30 60 90 120 Time (min) Relative kinase activity Dynamic processes of p38 activation by LPS in RAW cells MKK7(D) GST-ATF2 GST-ELK1 MKK1(E) MKK6(E) Control HSP27 PRAK Control Aniso. Arsenite TNF -80kDa -47kDa -39kDa -80kDa -47kDa kDa 97.4- 68.0- 43.9- 29.0- 18.4- 14.3- Control Aniso. Arsenite TNF A B The major kinases of p38? and p38 P38 MAP Kinase Pathway 蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定 Phosphopeptide map of HSP27 phosphorylated by PRAK in vitro Chromatography Electrophoresis pH1.9 + MAPKAPK2 Chromatography Electrophoresis pH1.9 + PRAK Chromatography Electrophoresis pH1.9 MIX + + + + + - - - - + - HSP27 p38? GST-PRAK(93A) GST-PRAK(WT) GST-PRAK(186A) GST-PRAK(212A 214A) GST-PRAK(182A) GST-PRAK(WT) GST-PRAK(182D) GST-