北师大生科细胞复苏与计数 课件.pptVIP

- * - - * - 细胞复苏及细胞鉴别与计数 - * - 什么是传代培养？细胞传代应注意哪些问题? 细胞胞传代培养的目的是什么? 贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同? 如何估计是否传代和传代的方式? 细胞冻存应注意的问题。 讨论 - * - 实验目的 掌握细胞复苏的基本方法 掌握用血球计数板进行细胞计数的方法。 学习死活细胞的鉴别方法 - * - 一、细胞复苏 原理：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。 复苏细胞原则：快溶。使培养物能快速通过对细胞有损害的－5～0℃摄氏度区域，细胞仍能生长，活力受损不大。 - * - 细胞复苏操作步骤 准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯40℃的温水。 从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 - * - 将冻存管放入离心管中800rpm离心10分钟，取出冻存管拿入超净台中，75%酒精消毒管口，打开冻存管，弃掉冻存液，沉淀加4ml培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养。 细胞复苏后，第二天换液去除漂浮未贴壁细胞，细胞长满后传代。经传代一至二次后，细胞即可恢复正常状态。 另取9滴细胞悬液加入1滴0.4%台盼蓝染色,取80μl细胞液镜下观察活力。 细胞计数方法：血球计数板和xxx。 血球计数板：由一块长约7.5cm，宽3.5cm的厚玻璃制成。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，盖上盖片后计数室的容积为 0.1mm3。所以，可根据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体积中细胞的数量。 - * - 细胞的计数与死细胞的鉴别 - * - 按以下方式计算细胞的浓度： 细胞计数的原则：细胞压格计上线不计下，计左不计右，如有少量两个以上细胞按一个细胞计数，如超过10%说明消化不充分。 4个大方格中的细胞数 4 × 104×稀释倍数= 细胞数/ml悬液 - * - 实验步骤 检查记数板：在正式计数前，先用显微镜检查记数板的计数室，看其是否沾有杂质或干枯的菌体。若有污物，则需作以下几步清洗： 擦洗 用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室。 冲洗 用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分注意：勿用内火焰来烤干）最后用擦镜纸揩干净。 镜检 镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数。 加样：先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2~3次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。 - * - 计数： 将加好样品的记数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作： 找计数室 先在低倍显微镜下寻找计数板上的大方格网位置。寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线，移动计数板，使计数室位于视野中间。 转高倍镜 转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野中。 计数 计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右和下的不计算在内。 清洗 计数完毕后，记数板先用95%酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。 细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数X100%  - * - 注意事项 加液时勿使液体漫过盖玻片或出现气泡。 镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。 如细胞团占10%以上，说明消化不充分， 细胞数少于20个/平方毫米或多于50个/平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液，再重新记数。 染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。 常见细胞污染的鉴别 如果是细菌污染，应该很快培基就浑浊了，常见为明显或不明显的成串状，生长很快，培养基很快变得似泥沙状混浊，黑点移动速度非常快。 如果是真菌感染，特别是初期污染，在低倍镜下可以看到小黑点，特别是成团的小黑点，要特别注意。如果无法确定，就换高倍镜，如果是死细胞或细胞碎片，高倍镜下就可以分辨，而真菌高倍镜下仍然是小黑点。 - * - 鉴别细胞污染的方法 - * - 常用方法 基本操作 优缺点 持续培养观察法 把疑似培养物单独标示出来，继续培养，24或48小时后再进行大体和镜下的观察，对比混浊度变化 优：稳妥、不容易误判和漏判； 缺：耗时、容易耽误细胞换液或传代以及发放时机 取样培养或涂片法 通过无菌操作取出部分培养物进行菌培养，或取出进行革兰氏染色镜下识别 优：客观、可以识别某些污染类型，利于排查 缺：相对繁琐，易在操作中引入新的污染、存在一定的假阳性或假阴性 直接镜下识别法 运用高倍镜（400倍）对疑似污染