人参二醇组皂苷对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡影响.doc

人参二醇组皂苷对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡影响 　【摘要】 　　目的 观察人参二醇组皂苷（PDS）体外对U251细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度PDS对U251细胞增殖活力的影响；吖啶橙染色观察PDS诱导细胞凋亡情况；流式细胞仪分析细胞周期并计算细胞平均凋亡率；免疫细胞化学技术观察细胞内半胱氨酸蛋白水解酶（caspase）9的表达。结果 经中（100 mg/L）、高（200 mg/L）剂量的PDS处理后，U251细胞生长受到不同程度抑制，且呈现剂量依赖性；吖啶橙荧光染色可见经中、高剂量PDS处理后的细胞呈现凋亡形态，并随药物剂量增加凋亡细胞数增多；流式细胞术结果显示，PDS可明显提高细胞的凋亡率，呈剂量依赖关系；免疫细胞化学染色结果表明，随着PDS剂量增加，细胞内激活的caspase 9的表达上调。结论 PDS体外对U251细胞增殖具有明显的抑制作用，其机制可能与诱导细胞凋亡有关。 【关键词】 细胞凋亡；人参二醇皂苷；细胞周期 　　人参为五加科多年生草本植物，其成分具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用〔1〕。人参皂苷是人参中主要的有效成分，迄今已确定结构的至少在30种以上，人参二醇组皂苷（PDS）即是其中一种，具有抗缺血再灌注损伤、清除氧自由基、抗氧化、阻滞钙通道等多种生物学效应〔2，3〕。本研究通过观察PDS体外对U251细胞增殖及凋亡的影响，探讨其抗肿瘤机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂 　　PDS由吉林大学药学院天然药物分析实验室提取；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品；激活的半胱氨酸蛋白水解酶（caspase）9多克隆抗体购于Takara公司，顺铂为山东齐鲁制药厂生产。 　　1.2 细胞系及培养条件 　　人胶质瘤细胞株U251(中科院上海细胞生物化学研究所提供)培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2湿化的培养箱中，待细胞长满80%培养瓶时，分组加药。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 实验分组 　　RPMI1640空白对照组（A组）；2 μmol/L顺铂组(阳性对照组，B组)；PDS低剂量（50 mg/L）组（C组）、中剂量（100 mg/L）组（D组）、高剂量（200 mg/L）组（E组）。 　　1.3.2 细胞形态观察 　　取对数生长期细胞,调整细胞密度为1×105接种于24 孔板,1 ml/孔。培养过夜后换新鲜的培养液,按前述分组加药，48 h后倒置显微镜下观察细胞形态。 　　1.3.3 MTT比色法 　　在96孔培养板，接种细胞1×105/孔，每组4孔，加药孵育20 h及44 h后每孔加MTT(5 g/L)20 μl，继续孵育4 h吸弃培养液，每孔加入DMSO 100 μl，震荡10 min，用酶标仪(波长570 nm)测定各孔吸光度值(A)，计算细胞生长抑制率，抑制率≥30%为细胞对该药敏感。抑制率=(对照组A值-给药组A值)/对照组A值×100%。 　　1.3.4 吖啶橙染色 　　将10 mg吖啶橙溶于100 ml、pH值为6.8的PBS中，过滤后4℃避光保存。细胞爬片经不同药物处理后，加入20 μl吖啶橙储存液，荧光显微镜下观察，拍照。 　　1.3.5 流式细胞仪检测 　　传代培养的U251细胞接种于培养瓶中（1×106/瓶），次日加药处理，48 h后收集细胞，冷PBS洗2次，-20℃、70%的冷乙醇固定，加入115 ml PI (50 mg/L)染色。混匀后上流式细胞仪做单参数分析，用累积曲线分割法计算各期细胞比例。 　　1.3.6 免疫细胞化学染色 　　将大小适合的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为5×105/孔，37℃、5% CO2中培养，次日加药，继续培养48 h，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，免疫细胞化学技术观察细胞内激活的caspase9表达情况。 　　1.4 统计学处理 　　数据处理采用SPSS9.0统计软件，数据以x±s表示,组间比较采用χ2检验。 　　　2 结 果 　　2.1 PDS对U251细胞生长的影响 　　2.1.1 细胞形态观察 　　A组细胞贴壁能力强，细胞生长旺盛，形态完好。经PDS处理48 h后,D、E组细胞形态均发生明显改变，即细胞呈现类圆形，周缘毛糙不规则，胞质中颗粒较多，贴壁能力下降，且出现悬浮细胞和细胞碎片，以E组较为突出，48 h后C组也可见少许死亡细胞出现。表明中，高剂量PDS体外可以抑制U251细胞生长。见图1。 　　2.1.2 不同药物对U251细胞增殖抑制作用 　　随着PDS浓度增加和作用时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐增高,且呈明显时间、剂量依赖性。见表1 。表1 不同时间PDS对U251细胞的增殖抑制率（略） 　　2.2 细胞凋亡检测