SDS-PAGE原理、试剂配制和注意事项.doc

SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂实验材料1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，溶解并至100ml贮棕色瓶中于4保存，可用一个月。（Acr）29g及（Bis）g 丙烯酰胺（Acr）及甲叉丙烯酰胺（Bis）2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液?? 取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4贮存。3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液?? 取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4贮存。1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液Tris18.171g完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至8.8，加水定容至100ml。室温保存。 100ml积层胶1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液Tris12.114g完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至6.8，加水定容至100ml。室温保存。 4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液SDS 5.g），用去离子水补至1000ml。pH 8.3。 5、10% 过硫酸铵（AP）过硫酸铵6、10%SDS（十二烷基磺酸钠）10%SDS无需灭菌。室温保存。 7、四甲基乙二胺（TEMED）8、上样缓冲液?? 取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。样品缓冲液：5ml1mol/l的Tris-HCl（pH6.7），2.5gSDS,1ml巯基乙醇，0.05g溴酚兰，10g蔗糖，加水定容至100ml。2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝0.0202g，1MTris·Cl（pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。 2×上样缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，4ml 50%的甘油，2ml 10% SDS， 2