课题二：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

3、 Taq细菌分离启示：要分离人民人们所需要的目的菌要从相应的自然中分离。 （三）、比浊法：是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，所以，可用光电比色计测定菌液。 （四）膜过滤法：是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上 ( 或一定面积中 ) 的细菌数 （一）分离方法：尿素唯一氮源选择分离法。 （二）统计方法：稀释涂布平板法。 （三）操作方法 1、制备培养基（按以下成分配制） KH2PO4 1.4g ； Na2HPO4 2.1g ； MgSO4﹒7H2O 0.2g ；葡萄糖 10.0g ； 尿素 1.0g ； 琼脂 15.0g 将上述物质 溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。 2、土壤取样 ◆从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3-8cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 3、样土的稀释 * * 课题2 土壤中分解尿素的 细菌的分离与计数 一、基础知识 1、植物是怎样吸收尿素的 （1）尿素的分子式：CO(NH2)2 （2）植物吸收矿质元素的主要形式：离子。 （3）尿素怎样才能转变为离子 CO(NH2)2 + H2O CO2 + 2NH3 细菌脲酶 （4）产生脲酶的细菌即为能分解尿素的细菌 2、 TaqDNA聚合酶与Taq细菌的分离 （1） TaqDNA聚合酶：在体外高温条件下催化DNA的复制。 （2） Taq细菌分离环境：热泉。 如：分离能分离尿素的微生物要从土壤中使用尿素的土壤；分离耐盐微生物要从滩涂和盐碱地分离；分离低温淀粉酶的微生物要从低温面粉加工厂的土壤和排水沟中。 4、分离所需的微生物所需的培养基：选择培养基 ①固体培养基。 ②培养基的氮源是尿素 KH2PO4 1.4g 提供无机盐 Na2HPO4 2.1g 提供无机盐 MgSO4﹒7H2O 0.2g 提供无机盐 葡萄糖 10.0g 提供碳源与能量 尿素 1.0g 提供氮源 琼脂 15.0g 凝固剂 将上述物质溶解后，用 提供水分 蒸馏水定容到1000mL。 1、利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物只是一种细菌吗? 思考： 不是，有多种，只要能产生脲酶的微生物 均能分离，因此，菌落的形态有多种。 如：芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、 克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌， 某些真菌和放线菌也能分解尿素。 2、请你提供一种方法，判断分解尿素的细菌确实能将尿素分解成氨。 思考： 方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂,接种培养该细菌，若 指示剂变红，说明该种菌分解了尿素。 3、要验证以尿素为唯一氮源的培养基对 土壤中的细菌确实具有选择作用，你该如何设计实验。 思考： 思路：制备牛肉膏蛋白胨培养基作为对照 组，尿素为唯一氮源的培养基为实验组， 接种等量的从同一土壤中采集的细菌，培 养、计数并比较两组培养基上的菌落数。 5、统计每克土壤中分解尿素的细菌数 探究设计 计数法 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 比浊法 膜过滤法 （1）、显微镜直接计数 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点 （2）、稀释涂布平板法（活菌计数法） 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 计算：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 三、体验分离、计数土壤中分解尿素的细菌的实验操作 4、取样涂布 ◆细菌用4、5、6涂布 ◆放线菌用3、4、5涂布 ◆真菌用2、3、4涂布 5、微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 注意事项 ①为了保证结果准确，一