DNA的复制-14.pptVIP

1958年M. Meselson 和 F. Stahl 用同位素标记证明半保留复制。 该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约12代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作氯化铯密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开，实验证明了DNA的半保留复制。 DNA半保留复制研究实验结果示意图 二、双向复制 原核生物： ? 基因组是环状DNA ? 只有一个复制起始点 复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，称为双向复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制），只形成一个复制叉。 复制叉：复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉(replication fork) 。 　 真核生物： ? 染色体DNA有多个复制起始点。 ? 两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。 ? 复制子是独立完成复制的功能单位。 真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉（动画演示） 冈崎片段： ? 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 ? 原核生物: 1000-2000个核苷酸 ? 真核生物: 100-200个核苷酸 3’→5’外切酶活性是从3’→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。 错误核苷酸进入polⅠ的结合位点不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'→5'外切酶活性位点所识别并切除。 5’→3’外切酶活性是从5’→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链。它只作用具切口的双螺旋DNA，并在切口以外的配对区切割。 DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成 二、DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。 解螺旋酶(helicase)：又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白。 每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。 SSB是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。 四、引物酶(primase) 依赖DNA的RNA聚合酶。 对利福平不敏感。 可以催化游离NTP聚合。 在大肠杆菌，是dnaG 基因的表达产物。 催化RNA引物的生成。 （三）DNA复制的终止 1、DNA复制的终点： 在DNA上存在着复制终止位点，某些蛋白因子可识别终止位点的序列，使DNA复制在终止位点终止。 E.coli的DNA复制终点序列： AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT TTAATCATACAACATTGATTTCA 大肠杆菌的两个复制叉在相距终点100kb时，复制速度减慢，从而协调2个复制叉到达的时间。终点A、D、E终止复制叉2；终点C、B、F终止复制叉1。 ? 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。 ? 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。 ? 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 ? 酵母DNA复制起始点为11bp富含AT的核心序列。 ? 复制起始包括打开复制叉、形成引发体和合成RNA引物。 ? 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 ?增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白质，包含在引物的识别复合物中。 PCNA的三个亚基绕着DNA形成一个滑动夹子（sliding clamp）,DNA聚合酶δ附着于滑动夹子上。在复制起始和延长中起关键作用。 真核生物端粒（telomere）的形成： 定义： 端粒是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。 线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。 端粒酶(telomerase) 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。 端粒酶(telomerase)的作用机制——爬行模型 端粒酶的爬行模型（动画演示） 突变 (mutation)： 是由遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。从分子水平来