生防菌的分离.ppt

实验一 生防菌的分离 一、实验目的 1. 掌握生防菌的分离方法、分离培养基与培养条件。 2. 观察生防菌如放线菌、细菌、真菌的菌落形态。 二、实验原理 采用稀释法、弹土法。将土壤样品接种到相应的分离培养基上培养，利用适宜生防菌生长的培养基与条件，分离不同种类的生防菌。 三、实验材料和仪器 1. 样品：土壤、植物（表面、体内）、果实。 2. 用品与仪器：三角瓶、刻度试管、灭菌水、称量纸、玻璃吸管、电子天平、超净工作台、微波炉。 3. 培养基： （1）高氏一号：培养放线菌。 （2）PDA：分离真菌; （3）KB：培养细菌。 2. 培养基与平板的制作： 高氏1号培养基： 淀粉 20g K2HPO4 0.5g NaCl 0.5g KNO3 1g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 10g 水1000ml。 已融化好的高氏一号培养基中加入K2Cr7O4溶液(每300ml加入100ppm 1ml)调至pH 7.2～7.4，待温度降至40℃时倒皿，皿/40毫升培养基。 B. 接种方法： d或e土壤溶液，每皿加入20～30μl，用吸管吸0.1ml(2滴)，取用无菌三角玻璃棒涂抹接种。 （2） 弹土法 每皿弹入约0.2毫克土壤样品粉末。 4. 培养： 放线菌28℃培养7-14 天 细菌3－5天 真菌5－7天 观察、调查菌落数、计数。 5．放线菌计数方法 采用平板菌落计数方法。 放线菌的分离计数用培养基（淀粉铵盐培养基）： 可溶性淀粉 10g, (NH4)2SO4 2g, K2HPO4 1g , MgSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g , 琼脂 18g, 水 1000ml , pH7.6～7.8。 实验方法 <1>熔化培养基倒皿，每皿12ml左右。设三个皿为对照(CK)，每个土样处理3个皿。培养基冷凝后，放入80℃的烘箱中，除去表面的冷凝水，一般烘10～15分钟。 <2>选取每皿放线菌菌落数20～200个的平板用于计数 五、实验结果的观察记录与实验课作业 放线菌的菌落特征 A：诺尔斯氏链霉菌 B：皮疽诺卡氏菌 C：酒红指孢囊菌 D：游动放线菌 E：小单胞菌 F：皱双孢马杜拉放线菌 单细胞真菌形态 芽孢杆菌的分离鉴定和活性测定 1．生长适温测定 将供试枯草芽孢杆菌单胞菌系接于牛肉膏蛋白胨培养液中(pH7.2)，置于25℃，30℃，35℃，40℃四个温度等级下培养，每日用血球计数崐板检测菌液的浓度。 2．适宜碳源测定 ① 培养基的制作：在无葡萄糖的营养洋菜中分别加入可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、蔗糖、甘露醇和桔粉(由广州糖果厂生产)，浓度为2％(W/V)，灭菌备用。 ② 培养测定：将供试单胞菌分别接于上述各培养基平板上，30℃下恒温培养72h后，测定菌落直径。 3．适宜氮源测定 ① 基础培养基制作：葡萄糖1％(W/V,下同)，NaH2PO4、K2HPO4各0.05％，MgSO4.7H2O 0.02％，CaCL2.2H2O 0.01％，琼脂10克，蒸馏水500ml，沸水中搅拌均匀，分成五等份，灭菌备用。 ② 氮源种类及含量：蛋白胨 0.5％，酵母汁 0.1％，牛肉膏 0.3％，NH4CL 0.1％，KNO3 0.1％，分别加入上述基础培养基中，灭菌备用。 ③ 培养测定： 4．定植、转移的研究 无菌条件下的定植、转移(无菌液培法) 供试作物：辣椒 (8819线辣子) 供试菌：Ｂ4-110，Ｂ-54两个菌系 生长容器：标本瓶(210×300mm) [产地：武汉] 瓶内放一特制网架(直径16.5cm，高8cm)，瓶口用5cm厚的脱脂棉和一层纱窗网封严。(15磅下蒸气灭菌20分钟，备用。) 培养液成分：Shive和Robbins营养液Ⅰ(1942) g／l Ca(NO3)2 0.938 (NH4)2SO4 0.0924 KH2PO4 0.313 MgSO4.7H2O 0.567 FeSO4.7H2O 5.5mg H3BO3 0.57mg MnSO4.4H2O 0.57mg ZnSO4.7H2O 0.57mg〔可用EDTA-Fe代替FeSO4〕 实验操作步骤 ①种子消毒与浸种催芽：种子用0.1％401杀菌剂浸泡4小时， 用无菌水冲洗后再浸种16小时；将双层滤纸(灭菌)铺到无菌培养皿中