梨黑色斑点病的病原鉴定及其对梨叶侵染的显微观察-植物病理学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文3．1．2供试培养基 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．1．2供试培养基 ．．3 1 3．1．3主要试剂 ．．3 l 3．2方法 ．32 3．2．1潮霉素B对果生炭疽菌生长的影响 ．．32 3．2．2农杆菌菌液的制备 ．．32 3．2．3转化子的获得 一32 3．2．4转化子菌株的鉴定 一32 3．2．5转化子菌株的筛选 ．35 3．3试验结果 35 3．3．1潮霉素对果生炭疽菌生长的影响 。35 3．3．2转化子菌株的获得及验证 ．36 3．3．3转化子的筛选 ．．38 3．4结论与讨论 39 第四章果生炭疽菌对梨叶侵染的显微观察 4l 4．1材料 ．4l 4．1．1供试菌株 一41 4．1．2试验材料 ．．41 4．1_3主要仪器及试剂 ．．41 4．2实验方法 41 4．2．1接种体的制备 ．．41 4．2．2‘翠冠’梨叶片的接种试验 4l 4．3试验结果 42 4．4结论与讨论 44 第五章全文结论与展望 46 参考文献 ．48 附录l主要试剂及溶液的配制 58 附录2硕士期间发表论文 59 附图 60 致谢 ．61 万方数据 梨黑色斑点病的病原鉴定及其对梨叶侵染的显微观察摘要 梨黑色斑点病的病原鉴定及其对梨叶侵染的显微观察 摘要 近年来，中国长江流域以南沿海沙梨产区新发生一种被称之为“梨黑色斑点 病”的叶部病害。该病造成梨树叶片大量异常脱落，不仅削弱树势，影响当年梨 产量和品质，造成严重的经济损失。然而引起该病害的病原及症状产生的机理不 明，生产上对该病害尚缺乏有效防治办法。本研究通过形态学观察、多基因测序 分析及致病性测定，旨在明确引起我国梨黑色斑点病的病原。在此基础上，为了 探讨黑点症状产生的机理，利用ATMT方法对梨黑色斑点病菌进行遗传转化， 筛选出遗传稳定、形态学特征和致病力相对野生型菌株没有发生显著变化的转化 子，在梨叶上接种标记病菌并荧光显微观察其侵染。取得的主要研究结果如下： 1．梨黑色斑点病的病原鉴定。2013年至2015年先后从我国福建、江西、广 西、湖北等发生了黑色斑点病的梨树上采集病叶，分离获得菌株447个，观察这 些分离物的菌落形态及无性态特征，并对福建省全部分离物及江西、广西、湖北 等部分分离物的ITS序列进行测定分析，397个菌株鉴定为炭疽菌。对福建省的 25个分离物进行多基因(GAPDH、CAL、ACT、CHS．1、TUB2及GS)及Apn2／MAT (ApMat)位点序列分析，结果显示397个炭疽菌为果生炭疽菌Colletotrichum fructicola。选取7个代表菌株在‘翠冠’、‘雪青’、‘华梨2号’梨叶片上进行致病性 试验，产生了与田间症状一致的黑点(S1 mm)，且无伤喷雾接种比金刚砂摩擦 接种引起的黑点数量要少。用3个分离物分别在梨、苹果、海棠等15种果树叶 片上进行致病性测定并分析其寄主范围，发现本研究中的分离物对沙梨和白梨具 有强致病力，对枣和葡萄没有明显的致病力。 2．果生炭疽菌FJ．85的GFP标记及转化子菌株的筛选。利用ATMT方法对 果生炭疽菌FJ-85进行绿色荧光蛋白标记，共获得转化子菌株130个，随机选取 23个转化子菌株，测定其潮霉素抗性和荧光稳定性，并采用RT-PCR方法检测 转化子插入的hph和．叻基因，对转化子进行验证；比较野生型菌株FJ一85和转 化子菌株的形态学特征、生长速度和致病性，筛选出形态学特征、生长速度及致 病性较野生型菌株均没有发生显著变化的转化子菌株FJ-85一I 14。 3．果生炭疽菌标记菌株FJ．85．114对‘翠冠’梨叶侵染的显微观察。用转化子 菌株FJ．85．114的菌丝块和分生孢子悬浮液，分别接种健康‘翠冠’梨叶片，观察 和比较不同接种方式在梨叶片上的侵染和扩展情况。结果显示，用菌丝块通过针 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文刺接种，叶片产生黑斑，且在荧光体视显微镜下可观察到菌丝还未到达的叶片组 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 刺接种，叶片产生黑斑，且在荧光体视显微镜下可观察到菌丝还未到达的叶片组 织变褐；用菌丝块通过无伤接种及用分生孢子悬浮液通过金刚砂摩擦和无伤喷雾 接种，叶片均产生黑点症状，倒置显微镜下初步观察到叶片栅栏组织与海绵组织 之问的组织变褐坏死，但在荧光显微镜下并未观察到菌丝在发病组织处的扩展情 况。由此推测黑点症状可能是由果生炭疽菌产生的次生代谢产物所引起的。 关键词：梨黑色斑点病；病原；ATMT；GFP标记；侵染；显微观察 万方数据 梨黑色斑点病的病原鉴定及其对梨叶侵染的显微观察Abstract 梨黑色斑点病的病原鉴定及其对梨叶侵染的显微观察 Abstract In recent years，a devastating