小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定.pptVIP

五、污染菌鉴定 3、如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。 4、如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。 五、污染菌鉴定 5、假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。 6、表中未列出的其他试剂条 API 20A试剂条可用于鉴定厌氧菌。API 20C AUX试剂条可用于鉴定酵母菌。 五、污染菌鉴定 7、选定正确的试剂条后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。 五、污染菌鉴定 （三）革兰染色试验 在细菌鉴定过程中，需要最先完成的一些实验称为基本定向生化试验。介绍革兰染色实验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。 五、污染菌鉴定 1、原理 由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚，细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色剂脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以致关闭，从而阻止了结晶紫-碘复合物的逸出，故而菌体呈现深紫色； 五、污染菌鉴定 而革兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当用酒精脱色时，脂类物物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘复合物被抽提出来，从而使菌体呈现复染液的红色。 五、污染菌鉴定 2、染色液的配制 2.1结晶紫染液 将A液（结晶紫2.0g溶于20ml95%乙醇中）与B液（草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水）混合，静置48小时后过滤。 五、污染菌鉴定 2.2卢戈碘液 取碘化钾2.0g溶于5ml蒸馏水中，再加入碘片1.0g，待碘全部溶解后，加蒸馏水至300ml即成。也可只加蒸馏水至100ml，配制母液储存，用时加两倍蒸馏水。 2.3脱色液 95%乙醇溶液。 五、污染菌鉴定 2.4复染液（0.25%的沙黄液） 取沙黄0.25g溶于95%乙醇10ml中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。 3制片、染色操作 在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌龄为18-24小时的菌苔与水滴充分涂抹混匀成1cmX1cm大小区域的菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过几次，以固定涂片。 五、污染菌鉴定 滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上的水甩干。滴加95%乙醇脱色约20-30秒，并立即用水冲净。滴加沙黄液染1-2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。 五、污染菌鉴定 4阳性-阴性对照控制 取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液，制成细菌涂片；或是使用已知的革兰阳性细菌和阴性细菌制成涂片，分别染色操作后作为阳性和阴性的对照控制。 5镜检观察 在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。 六、注意事项 1、小容量注射剂5ml生产线处于正常生产状态。 2、因为是工艺试验的批次，生产结束后应立即进行彻底的清场，必要时进行清洁灭菌后的效果确认。 六、注意事项 3、试验过程中相关活动必须详细真实记录，如具体的取样时间，进行检测的时间等，样品取样和检验需编号管理，要求及时正确标识清晰。取样注意按计划进行，避免样品的漏取和错标。 4、样品应及时传递，QC第一时间安排进行微生物限度检查。 * 三、试验方案 3、依据标准及相关文件 《药品GMP指南》无菌药品 《药品生产验证指南》2003年版 《中华人民共和国药典》2010年版 《XX注射液工艺规程》 三、试验方案 《现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术》 4、取样器具 取样瓶为250ml无菌玻璃磨口瓶。 三、试验方案 （四）检验方法 采用薄膜过滤法进行药液的微生物限度检查。取滤膜孔径 0.45μm，直径为 75mm的一次性全封闭薄膜过滤器（北京牛牛基因技术有限公司，滤器类型：NS01-75D1），将过滤器逐一插放在滤液槽座上，将其塑胶软管装入集菌仪的蠕动泵的管槽内，注意定位准确，软管走势顺畅。 三、试验方案 其进液软管的双芯针头插入供试液容器的塞上，开启集菌仪，将供试液容器倒置，使药液均匀通过滤器，滤净。打开过滤器菌面朝上贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备一张滤膜。细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计