02实验二蛋白质n端分析.ppt

Dansyl－氨基酸的聚酰胺薄膜层析 DNS化反应 DNS-肽和 DNS-蛋白质的水解 DNS-肽和 DNS-蛋白质被6.0 mol/L的盐酸水解，释放出带有 N末端标记的DNS-氨基酸。 层析法又称色层分析法、层离法、色谱法，能有效地分离结构相似，挥发度都十分相近化合物。 聚酰胺薄膜层析 将一定量的样品加到聚酰胺薄膜上，当让合适的有机溶剂在薄膜上渗透展开时，样品便在流动相和固定相之间反复地进行分配，由于样品中各组分的在两相中分配系数不同，各组分随流动相迁移的速度也不同，最后不同组分可以完全分离。 Rf值 Rf= AC／ AB A：样品起点 C：层析终了时样品的色层中心 B：溶剂前沿 AB：样品起点到溶剂前沿的距离 AC：样品起点到样品色层中心的距离 聚酰胺薄膜层析 分离原理： 各种被分离物在展层剂中的溶解度及被分离化合物与聚酰胺形成氢键能力的大小的不同，决定它们在展层过程中迁移的速度不同。 胰岛素 展 层 展层剂：甲酸（88%）：水=1.5 ：100（V/V） 1、展层10-15分钟，等溶剂前沿到达离聚酰胺薄膜顶端1.0 cm 时，停止展层。 2、标记溶剂前沿。 DNS-氨基酸双向展层 * * * 实验二 基本原理 荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯（ DNS-Cl ）在碱性条件下与氨基酸、肽和蛋白质N末端的氨基反应，分别生成带有荧光标记的DNS-氨基酸、DNS-肽、 DNS-蛋白质。灵敏度10-10摩尔。 Dansyl－Cl 标记N末端氨基酸 Rf值的大小表示物质在纸上走的快慢 B C A C 聚酰胺（尼龙）： 己二酸和己二胺的聚合物 nHOOC(CH2)4COOH + nH2N (CH2) 6NH2 -HN-CO -(CH2)4 –CO-NH (CH2) 6NH-CO- 分子中含有大量的酰胺基团 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜：将聚酰胺均匀涂在涤纶基片上，干燥后制得的薄膜。 聚酰胺薄膜含有-CO-和-NH-基团，能与被分离的化合物形成氢键，因此可以吸附酚类、酸类（核苷酸、氨基酸）、醌类、硝基及胺基等化合物。 聚酰胺薄膜层析 展层过程： 将DNS-氨基酸点在聚酰胺薄膜上（固定相）， 薄膜的底端浸泡在展层剂中。展层剂（流动相）在 毛细管作用下向薄膜的上端移动，DNS-氨基酸随展层剂向薄膜的上端移动。 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜层析 迁移率： Rf = 被分离化合物的移动距离 溶剂前沿的移动距离 实验步骤 1、加样（加样前把试管洗干净！！） 试管 1、 0.2ml Phe 溶液＋0.2ml DNS-Cl溶液 试管2、 0.2ml Gly 溶液＋0.2ml DNS-Cl溶液 2、薄膜封口，40oC反应