分子生物学2010-53讲解学习.ppt

流式细胞仪 应用 细胞因子的联合检测 感染性疾病的联合诊断 研究RNA与蛋白质之间的相互作用 临床应用 遗传性疾病的诊断 Sickle-cell anemia（镰状细胞性贫血） Cystic Fibrosis（囊性纤维化） Alpha-1-Antitrypsin Deficiency （α- 1 -抗胰蛋白酶缺乏症 ） 分子生物学与医学检验 医学检测技术进展 Molecular Biology and Laboratory Medicine 分子诊断学的发展 分子诊断学 以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。 分子生物学与医学检验 历史回顾 常规技术 边缘技术 未来发展 Kan等用液相DNA分子杂交技术成功的进行 镰形细胞贫血症的基因诊断 —— 检验诊断进入基因诊断时代 分子诊断学的发展 分子诊断学的发展 Polymerase Chain Reaction (PCR) 技术发表 1990s 人类基因组计划（HGP）启动 1999 The journal of Molecular Diagnostics 出版 分子诊断学的发展 三大阶段： DNA分子杂交技术——遗传病的基因诊断 PCR技术——病原体检测及多基因遗传病 组学技术（ The Age of “Omics” ） ——高通量密集型检测技术 常规技术 常规技术 细胞水平 分子水平 组学技术 DNA 免疫印迹 Protein ELISA PCR 测序 流 氏 细 胞 仪 各类 Microarray 常规技术 基因结构异常 基因表达异常 蛋白质 m-RNA DNA 核酸分子杂交 PCR DNA测序 逆转录PCR Real-time PCR Nothern-blot Western-blot 蛋白质组织化学染色 ELISA 分子杂交类型 分子杂交技术 DNA of various sizes Electrophorese on agarose gel gel Denature - transfer to filter paper blot 分子杂交技术 Hybridize to probe Visualize 分子杂交技术 细胞遗传学 产前诊断 病原体诊断 PCR PCR 高灵敏度 高特异性 快速 优 势 PCR PCR PCR法检测乙肝的优势表现在： ① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，在感染潜伏期即可被PCR法检出。 ② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。 ③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。 Western-blot 原理:在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测 Western-blot 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 流程 新兴技术 新兴技术 脉冲场凝胶电泳技术 流式细胞仪的新应用 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 原理: 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。 脉冲场凝胶电泳（PFGE） The size of DNA is 30~50 kb The size of DNA larger than 50 kb 脉冲场凝胶电泳（PFGE） How we separated the larger DNA fragments, such as chromosome? 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 原理:细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。 流式细胞仪 流式细胞仪(flow cytometer，FCM)是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论、细胞荧