病毒的检测病毒感染微生物方法ch26.ppt

病毒感染的检查方法 电镜技术 血清学试验 分子生物学技术 病毒的分离鉴定 标本采集与送检 一、标本采集与送检 原则： 1. 尽早采取：发病初期 2. 部位适宜：由感染部位采取 3. 冷藏速送：装有冰块或干冰的容器内 （一）供分离病毒、检出核酸及抗原的标本 （二）检测特异性抗体 的标本 采集双份血清， 4-20 ℃保存 病毒材料采集与检验结果的关系 采取标本的时期 检查病毒及其成分 测定抗体 潜伏期及前驱期 刚发病或急性期 恢复期及康复期 较难查见 最多查见 很难查见 未增多 未增多或增 多不明显 明显增多 （常超过 4 倍） ? 病毒分离是诊断病毒感染的金标准，一旦阳性，即 可确诊。 ? 不适用于快速诊断，操作复杂，实验成本高，阳性 检出率低等 ? 有时不得不分离病毒，例如发现了一种新的病毒病， 必须分离病毒进行研究，或者分离株的鉴定对流行 病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫 苗，或者希望获得天然弱毒株等。 二、常规分离与鉴定 （一）病毒分离 标本采集 杀灭杂菌 （ 青链霉素 ） 接种 鉴定病毒种型 易感动物 出现病状 鸡胚 病变或死亡 细胞培养 细胞病变 三大方法 （二）病毒鉴定 1. 形态学鉴定 观察 CPE 。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、 溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。 正常细胞 病变细胞 ? 感染细胞具有吸附红细胞的能力 ? 感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞 的作用 2. 血吸附和血凝作用 多见于以出芽方式释放的病毒。 红细胞吸附 正常细胞 （ 1 ）血吸附作用 吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定 具有吸附特性的病毒 （ 2 ）血凝作用 血凝试验 血凝抑制试验 （ 3 ）病毒成分的直接检测 用免疫学或分子生物学技术直接检查感染 细胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。 三、 电子显微镜检查 病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借 助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态 又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液， 或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子 显微镜检查，直接观察病毒粒子。 透射电子显微镜 1. 正染法：超薄切片法 取材 固定 戊二醛 四氧化锇 清洗与 脱水 浸透 包埋 聚合 切片 染色 铀染 铅染 鸡痘病毒（超薄切片） 超薄切片法的优缺点： ? 优点： 可观察病毒形态和形态发生过程 ? 缺点： 操作复杂，费时，但标本可长时间保存 2. 负染技术 负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而 加强样品外周的电子密度，使样品显示负的 反差，衬托出样品的形态和大小。 铜网 样品 滤纸 染液 （常用磷钨酸） 1-2 分钟后电镜观察 口蹄疫病毒的电镜负染 负染法的优缺点： ? 优点： 快速简易（ 10-20min ）；分辨率高；图象清晰 地病毒结构 ? 缺点： 敏感性低，要求病毒量在 10 7 以上；所有样品应处 于悬浮状态 免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电 子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微 结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高 度精确、灵敏的方法。 3. 免疫电镜技术 ( Immune electron microscopy ， IEM ) （ 1 ）免疫凝集电镜技术 抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚 集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏 感性，确定病毒的血清学性质。 （ 2 ）免疫电镜定位技术 特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标 记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察 到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。 酶标记染色 四、 血清学试验 是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用 ELISA 、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术 等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和 发病组织中的病毒抗原。 virus 1. 中和反应 观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否 抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结合，使其失 去感染力的抗体又称中和抗体。 2. 补体结合反应 Ag Ab 红细胞 溶血素 补体