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土壤分离纤维素酶分解菌及其酶活研究 （杨娜 中国农业大学生物学院01级3班 0109303） 摘要：纤维素是一种可再生资源，广泛应用于工农业、医药生产等领域。纤维素是植物体内结构多糖，植物的枝叶和秸杆等都含有大量的纤维素。自然界中的纤维素，通过纤维素分解菌将其自然分解，因此，发掘这些微生物的资源，充分利用纤维素，将是一项有益的工作。微生物产生纤维素酶由于具有设备简单、反应条件温和以及不污染环境等优点，在所有方法中脱颖而出。本实验选取了五种不同生存环境下的土壤样品，用以纤维素为唯一碳源的培养基进行分离和提纯，并经过多次液体转接和平板培养，选出了三种酶活性较高的菌株，并用DNS法测定了其酶活性。 关键词： 纤维素分解菌 纤维素酶 酶活 前言：1912年从Pringsheim耐热性纤维素细菌分离出纤维素酶后，人们便开始了纤维素微生物酶的研究与应用。纤维素酶包括多种水解酶成员，构成了一个复杂的纤维素酶家族，一般将纤维素酶分为三类：(l)葡聚糖内切酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4，简称EG)，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖昔键将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。(2)葡聚糖外切酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91)，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-糖苷键每次切下一个纤维二糖分子，故又称纤维二糖水解酶(cellobiohyd rolase，简称CBH)。(3)β-葡萄糖苷酶（β-GluCoSidase，EC 3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。 人们研究的纤维素酶主要是来自细菌和丝状真菌的纤维素酶。细菌产生纤维素酶的量较少(低于 0.1 g/L)，主要是EG，大多数对结晶纤维素没有活性.多数不能分泌到细菌细胞外。丝状真菌能产生大量的纤维素酶(20 g/L)，其中尤以木霉属的产量居上。李氏木霉（Trichoderma reesei）、绿色木霉（7.Viride）等是木霉属中活性较高的菌种。真菌产生的纤维素酶三类酶都有，能分泌到菌体外，一般不聚集形成多酶复合体，但相互间发生强烈的协同作用（纤维素系统表现出总的酶活性高于各种酶单一性的加和）。 材料与方法： 一、实验材料： 1．土壤样品： G ： 时间：2004年1月28日前后 地点：河南省郾城县龙城镇一庭院 环境：园中植有桐树 周围堆有秸秆、枯枝覆盖 X20: 新疆焉耆县糖厂堆泥 X45: 前进公社 棉花地 X9： 天池 林地灌木下红浆果 M-1： 坡地 海拔1000M树底下土壤，周围有很多低矮的植物 2．培养基及试剂： a 、纤维素液体培养基 NaNO3 0.5 g KCl 0.5 g K2HPO4·7H2O 1.0 g MgSO4·7H2O 0.5 g Fe(SO4)3·7H2O 痕量 纤维素 2.0 g H2O 1000 ml pH 5.5 7.0 8.0 b 、纤维素固体培养基 在a的基础上加入2% 的琼脂 c 、PDA土豆固体培养基 土豆 200 g 葡萄糖 20 g 琼脂 20 g H2O 1000 ml pH 6.5 （8磅灭菌，30分钟） d 、pH为5.4的缓冲液 溶液A：冰醋酸11.55 ml，定容至1000 ml 溶液B：乙酸钠16.4 g，溶解后定容至1000 ml 分别取A液8.8 ml和B液41.2 ml混合成100 ml的缓冲液 e 、pH为7.0的缓冲液 溶液A: K2HPO4·3H2O 9.1228 g，溶解后定容至200 ml 溶液B: KH2PO4 10.8872 g，溶解后定容至400 ml 分别取A液157.5ml和B液342.5ml混合成500ml的缓冲液 f 、pH为6.5的缓冲液 溶液A: NaH2PO4 27.8 g，溶解后定容至1000 ml 溶液B: NaH2PO4·7H2O 53.65g，溶解后定容至1000 ml 分别