《生物制药工艺学》9亲和层析.pdf

第九章 亲和纯化技术 掌握亲和层析的基本原理，亲和吸附的制 备要点，包括载体和配基的选择及其他措施 熟悉亲和层析的基本操作；洗脱条件的控 制及提高分辨力的方法 了解亲和层析的用途，发展和主要化学反应 亲和纯化技术 •亲和层析(Affinity chromatography) •亲和过滤（膜分离） •亲和分配（双水相萃取） •亲和反胶团萃取（反胶团萃取） •亲和沉淀（沉淀） •亲和电泳（电泳） 概 述 基本原理和过程 亲和层析－利用生物大分子物质具有与某些相应的 分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术 亲和力－功能相关的生物分子之间的专一可逆的结 合力，由范得华力，氢键，疏水力，静电力 等联合构成。 亲和对－相互存在着这种亲和力的两种物质。 分配体和配基 亲和吸附剂：载体—配基 • 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。 • 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。 过程： 1)配基固定化 选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成 具有特异性亲和性分离介质。 2)吸附样品 亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与 层析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。 3)样品洗脱 选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活 性物质洗脱。 L ＋ S L S 配基 样品 ＋ L L 配基固定化 L ＋ S L S ＋ 杂质 吸附样品 L S L ＋ S 样品洗脱 • 亲和层析的特点 • 亲和层析的载体 • 亲和配基 • 载体的活化和偶联 • 影响吸附剂亲和力的几个因素 • 配基与间隔臂的连接 • 亲和层析的吸附和洗脱 特点 • 经过一次处理可得到高纯度活性物质，适用于从 成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提 纯目标物，且可区分目的物有无活性 ； • 设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度 快、分离效果好、分离条件温和； • 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。 亲和层析载体 一.对载体的要求 作用：使配基固定化，提供亲和对特异性结合的空间环境 要求：1)具足够数量的功能基团，可与配基稳定的结合。 2) 具有较好的物理化学稳定性和生物惰性，尽量减 少非特异性吸附。 3)载体应具有高度的水不溶性和亲水性 4)载体的结构应是均匀的多孔网状结构且足够大。 5）外观为大小均匀的刚性小球，可保持良好疏通 常用载体 •纤维素 (cellulose) •琼脂糖凝胶 •葡聚糖凝胶 •聚丙烯酰胺凝胶 •多孔玻璃珠（Bio-Glass） •其它载体——壳聚糖 (Chitosan) （一）纤维素 廉价，来源充足； 纤维素结构紧密，均一性差，不利于大分子渗入， 活化后带有电荷，非特异性吸附力较强 有空间位阻,应用不如凝胶载体广泛 主要用于分离与核酸有关的物质 （二）琼脂糖凝胶 结构：D－半乳糖和3，6－脱水－L－半乳糖相互 结合的链状多糖。 商品名：Sepharose 2B等；Ultrogels A-2等 性质： 1.高亲水性，结构疏松，可使分子量上百万的物质 通过 2.理化性质稳定 3.对蛋白质几乎无非特异性吸附 4.通过溴化氰及环氧乙烷类试剂活化，引入活化 基团，可在较温和条件下连接较多配基 5.不能干燥和炼干，经不起有机溶剂的处理 （三）葡聚糖凝胶 葡聚糖经环氧氯丙烷交联而成的产物。 具有良好的理化