实验十七、酵母RNA的提取及组分鉴定.docVIP

实验十七、 酵母RNA的提取及组份鉴定 1、目的要求 （1）了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。 （2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 2、实验原理 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。 酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。 RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。 3、试剂和器材 一、试剂 0.04M NaOH溶液；95%乙醇；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银。 酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。 三氯化铁浓盐溶液：将2mL 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL浓HCl。 苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。 定磷试剂： 17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中； 2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中； 10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液； 临用时将三种溶液和水按下列比例混合： 17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。 二、材料 干酵母粉。 三、器材 移液管0.2mL（×1）,2.0mL（×1）, 1mL（×4）; 量筒10 mL（×1）, 50mL（×1）; 滴管；水浴锅；离心机。 4、操作方法 一、酵母RNA提取 称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算： ? 二、RNA组份鉴定 取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。 1．嘌呤碱：取水解液1mL 加入过量浓氨水。然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。 2．核糖：取水解液1mL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。 3．磷酸：取水解液1mL，加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。 5、思考题 1．为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ 2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?