姬松茸多肽抗衰老作用及其机制研究.pdf

摘 要 目的：探讨姬松茸多肽的抗衰老作用及其机制。 方法：硫酸铵沉淀及酶解法提取多肽，DEAE-32，Cellulose CM-52 和Sephadex G-25柱层析纯化得ABp；继续利用Superdex 30柱层析纯化得到ABp-S2，分析 ABp-S2 中组分构成；ICR 小鼠分为空白对照组 （Con）、模型组 （Mod）、吡拉 西坦组 （Pir）及姬松茸多肽组 （ABp）；通过避暗仪和Morris 水迷宫测试小鼠 的学习记忆能力；检测小鼠血清中丙二醛 （Malondialdehyde,MDA）、总抗氧化 能力 （Total antioxidant capacity,T-AOC）、过氧化氢酶活性 （Catalase,CAT）和活 性氧 （Reactiveoxygen species,ROS）含量，HE 和免疫双荧光染色法观察海马神 经元结构变化；转录组学测序 （RNA-seq）分析基因的差异表达；qRT-PCR 验证 显著差异基因mRNA 表达量；Westernblot 检测脑组织中Keap1、Nrf2、HO-1、 P53、Hsph1、Apoe、Trim32 蛋白表达量。利用MTT 法检测ABp-S2 中不同多肽 对衰老细胞的修复率。小鼠胚胎成纤维细胞 （NIH/3T3）分为Con 组、Mod 组、 姬松茸多肽低剂量组 （ABp-RQR-L）、姬松茸多肽中剂量组 （ABp-RQR-M）姬 松茸多肽高剂量组（ABp-RQR-H），检测细胞外液中CAT、MDA、ROS、T-AOC、 炎症因子白介素-1β （interleukin-6，IL-1β）、炎症因子白介素-6 （interleukin-6， IL-6）、肿瘤坏死因子 （tumornecrososfactor，TNF-α）含量。β-半乳糖苷酶染色 法观察细胞形态及阳性细胞百分率。Western-blot 法检测Keap1、Nrf2、HO-1、 TLR4、NF-κBp65细胞因子表达水平以及应用ML385 阻断剂后Nrf2、HO-1蛋白 因子的表达变化。 结果：经柱层析纯化分离纯化后得单峰即为ABp，分子量 （M）3kD；ABp-S2 由多肽ABp-RRQ、ABp-RQR、ABp-TRAR 构成；其中ABp-RQR 为主要活性成 分；与Mod 组比较，ABp 组小鼠水迷宫及避暗潜伏期缩短，错误次数减少 （P ＜0.05）；血清中CAT、T-AOC 明显升高，ROS、MDA 含量下降 （P＜0.05）； HE 染色结果显示ABp 组神经元排列紧密，核固缩细胞数量减少；ABp 组与Mod 组比较，筛选出差异基因295个，基因上调有79个，下调216个；qRT-PCR 验 I 证结果显示ABp 组脑组织中Hsph1、Trim32、HK1、HnRNPA1、Grik5mRNA 表达量增高，Apoe、Atp1a3、Stxbp1、Mapk8ip1mRNA 表达量降低 （P＜0.05）。 Westernblot 结果ABp 组脑组织Keap1、P53 蛋白表达量降低，Nrf2、HO-1、Hsph1、 Trim32 蛋白表达量升高 （P＜0.05）。与Mod 组比较ABp-RQR 各组中SOD、 CAT活性增强，MDA及ROS含量降低，IL-1β、IL-6及TNF-α含量下降（P＜0.05）； β-半乳糖苷酶染色显示ABp-RQR各组与Mod组比较形态规则且阳性细胞数目减 少 （P＜0.05）；与Mod 组比较ABp-RQR 各组中Nrf2、HO-1、TLR4、NF-κBp65 表达升高，Keap1表达降低 （P＜0.05）。ML385 干预后ABp-RQR 组Nrf2 及 HO-1细胞因子表达减弱 （P＜0.05）。 结论：ABp 可以改善衰老模型小鼠体内的氧化应激损伤，起到抗衰老的作用； 具体机制可能通过调控相关因子Apoe、Hsph1、Trim32、Atp1a3、Stxbp1、 Mapk8ip1、HnRNPA1、Hk1、Grik5mRNA 的表达有关；ABp-RQR 可以改善D-gal 诱导的NIH/3T3 细胞的衰老；具体机制可能通过调控 Keap1/Nrf2/ARE 和 TLR4/NF-κBp65信号通路减轻氧化-炎症反应以产生抗衰老作用。 关键词：姬松茸；ABp-RQR；衰老；Nrf2/ARE；TLR4/NF-κBp65