软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)(最新编写）.pdf

*** Soft Agar Assay for Colony Formation*** ***软琼脂克隆形成实验步骤 *** 注意 软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑 料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有 细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞 的密度每平方厘米不超过 35 个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆 形成试验。 1、配制 100ml 的 1.2% Argrose 和 0.7%Argrose ，Argrose 用 DNA 电泳用 BIOWEST REGULAR Argrose G10 （4 ℃），溶剂用双蒸水（DDW ），高压灭菌后，维持在42 ℃ 中不会凝固；配制500ml 的2 ×1640 和 0.005% 的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度 42 ℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解 1.2%Argrose 下胶和 0.7% Argrose 上胶，降温后 放入 42 ℃水浴锅中保持。 4 、根据实验需要的量配制20%FBS+2 ×1640+2×PS （5 种细胞配 40ml ），每种细胞设3 个复孔。 5、铺下胶 按 1:1 比例使 1.2%Argrose 下胶和 20%FBS+2 ×1640+2×PS 混合，6 孔盘每 孔迅速加入 1.5ml 混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气 泡）。对于一个 6 孔盘，配 5ml 上述培养液+5ml 1.2%Argrose 下胶于 50ml 离心管中（离 心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数 取对数生长期细胞，用 0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 4 作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至 40 ×10 ／ml 以上，这样加的体积小于 100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺 1 万个细胞，准备 4 个孔的细胞数， 4 即4 ×10 。 7、铺上胶 按 1:1 比例混合0.7% Argrose 上胶和 20%FBS+2 ×1640+2×PS ，每种细胞需 先配 2ml （20%FBS+2 ×1640+2×PS ）+2ml0.7% Argrose 上胶于离心管中混匀，放入 42 ℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入 6 孔盘中，每孔 1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO ，37℃，培养2 －3 周。 2 8、间隔2 天补加 200ul 10%FBS+1640+1 ×PS ，以防过于干燥。 9、计数克隆 把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择 10 个视野，计数 视野中大于 50 个克隆数 (﹥0.05mm 的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于 50 个克 隆数\所有克隆数×100%。每孔加入 1ml 的0.005%结晶紫染色 1h 以上，镜下拍照。 2 2 10、数据处理 每个视野的面积是 1mm ,6 孔盘每孔的面积是 9.6cm ,则一个孔中总的克 隆数=平均克隆数×960，如果要比较﹥0.05mm 的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥ 0.05mm 的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组 的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm 的克隆的绝对值，就得到总细胞克 隆数相同条件下的﹥0.05mm 的克隆的绝对值，可进行比较。