《精品》膜片钳实验与技术.ppt

;.; * 　　电压钳技术是通过一个反馈电路使膜电位保持在指定的水平，当离子通道开放产生跨膜电流，导致膜电位改变时，可通过反馈电路经微电极向胞内注入电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，使膜通透性发生改变时膜电位保持不变，此时注入电流的变化就可反应膜电导或膜电流的改变。电压钳技术工作原理如示意图： ;.; * ;.; * ;.; * 2、膜片钳技术 1976年Neher和Sakmann完成电极与膜之间50MΩ的封接，首次记录到去神经蛙肌纤维膜上的单通道电流，为证实生物膜离子单通道是以全或无规律、随机开放关闭的假说提供了有力依据。但是，当时实验记录的背景噪声较大。1980年，Neher利用负压吸引实现了GΩ封接，背景噪声显著减低。1991年膜片钳技术的创始人Neher和Sakmann荣获诺贝尔医学或生理学奖。 ;.; * Patch clamp Erwin Neher Bert Sakmann 1944~ 1942~ ;.; * 　　膜片钳技术是用尖端直径1~2μm的玻璃微电极吸管与经蛋白酶处理干净的细胞膜接触，通过20~30cm H2O的负压吸引造成电极尖端与细胞膜形成高阻封接（10~100GΩ），使电极尖端下的小块膜片与膜的其它部分在电学上绝缘，并在此基础上固定膜片电位，监测几个μm2膜片上1~3个离子通道活动的方法。 膜片钳技术可用一根玻璃微电极同时完成膜片（或全细胞）电位的监测、钳制及通道电流的记录。 ;.; * 膜片钳技术具有1pA的电流分辨率，10 μs的时间分辨率和1 μm2 的空间分辨率，使其成为在活体细胞上进行电生理学研究的重要手段。 随着该技术的逐渐完善及应用，目前已成为从功能角度探讨各种生理、病理生理及药物作用机制最直接、最理想的电生理学研究方法，也为多学科探讨生命活动规律、疾病与转归机理及药物作用等细胞和分子水平的研究，开辟了广泛前景。 ;.; * ;.; * 3、膜片钳记录的模式 根据研究需要及记录膜片的不同，膜片钳记录可形成以下四种基本模式 1.细胞贴附式（cell attached patch） 2.内面向外式（inside-out patch） 3.外面向外式（outside-out patch） 4.全细胞记录式（whole cell recording） ;.; * ;.; * ;.; * 4、膜片钳实验系统的组建 　　膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同而有所区别，但其基本组成是相同的，包括膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器以及防震台和屏蔽罩等。 ;.; * ;.; * 视频监视器 温度控制系统 倒置显微镜 探头 微操纵器 模数转换器 膜片钳放大器 数据采集及分析软件 计算机 ;.; * 五、膜片钳实验方法 膜片钳实验方法包括： 微电极的制备 细胞标本的制备 高阻封接的形成 离子单通道电流的记录或全细胞记录 ;.; * ;.; * 1、微电极的制备 　　微电极是用拉制器由玻璃毛细管拉制而成。玻璃微电极的选材和拉制质量直接影响封接电阻及记录时的噪声大小。 （1）选材 膜片钳实验用微电极可根据不同记录模式选用不同的玻璃毛细管拉制。从玻璃毛细管材料方面,可分为软质玻璃和硬质玻璃两类。 ;.; * （2）拉制 膜片钳实验用微电极与细胞外记录和细胞内记录用微电极不同，其尖端较短，锥度较大，尖端直径为1~5μm，充灌林格氏液时阻抗约1~5MΩ，因此一般采用两步拉制法。第一步将玻璃软化，拉出一个长7~10mm、直径200~400μm的杆，第二步再从杆中央以较小电流拉出两根尖端锥度较大的微电极。 ;.; * （3）处理 微电极拉制成功后，其尖端需进一步处理。这一过程包括涂硅酮树酯（sylgard coating）和热抛光（heat polish）。前者是将硅酮树酯涂于微电极尖端以外部分，达到使浸入浴液中的微电极表面呈疏水性，减小电极内部与溶液之间的电容。 　　热抛光是在显微镜下，将微电极尖端接近热源（通电加热的铂丝或白金丝等），使电极尖端表面变得更加宽阔和光滑，经热抛光处理的微电极可使高阻封接的成功率明显提高。 ;.; * （4）充灌 微电极使用前要充灌电极内液，电极内液需经0.2μm的滤膜或滤纸过滤。充灌时首先将电极尖端浸入电极内液，利用虹吸作用使尖端部分充满液体，然后再从电极尾端充灌。在充灌中应避免电极内出现气泡，如有气泡可使电极尖端向下，轻敲管壁除去。也应避免充灌电极内液太多，否则影响实验噪声基线。 ;.; * 2、细胞标本的制备 　　除脑片膜片钳和盲膜片钳法之外，实验所