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参考医学 原核表达操作步骤及注意事项 时间： 2010-03-03 14:05:01 来源： 作者： 点击： 1046 次 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋 白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及 与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化 等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种 元件： （1 ）选择标志的编码序列； （2 ）可控转录的启动子； （3 ）转录调控序列 (转录终止子，核糖体结合位点 ) ； （4 ）一个多限制酶切位点接头； （5 ）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白 的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、 LB 培养基。 2 、 100mM IPTG （异丙基硫代 - β-D- 半乳糖苷）： 2.38g IPTG 溶于 100ml ddH2O 中， 0.22 μm滤膜抽滤， -20 ℃保存。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过 PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别 引入不同的酶切位点）， PCR 循环获得所需基因片段。 2 、通过 RT-PCR 方法：用 TRIzol 法从细胞或组织中提取总 RNA ，以 mRNA 为模板，逆转录形成 cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行 PCR 循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后， 用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。 2 、 PCR 产物双酶切后回收，在 T4DNA 连接酶作用下连接入载体。 参考医学 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，根据重组载体的标志（抗 Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂 解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2 、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或 亚克隆至不同酶切位点。 3 、以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。 （四）诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至 2ml LB （含Amp50μg/ml ）中 37 ℃过夜培养。 2 、按 1 ∶50 比例稀释过夜菌，一般将 1ml 菌加入到含 50mlLB 培养基的 300ml 培养瓶中， 37 ℃震荡培养 至 OD600 ≌0.4-1.0 （最好0.6 ，大约需 3hr ）。 3 、取部分液体作为未诱导的对照组， 余下的加入 IPTG 诱导剂至终浓度 0.4mM 作为实验组， 两组继续 37 ℃ 震荡培养 3hr 。 4 、分别取菌体 1ml ，离心 12000g ×30s 收获沉淀，用 100 μl 1%SDS 重悬，混匀， 70 ℃ 10min 。 5 、离心 12000g ×1min ，取上清作为样品，可做 SDS等分析。 三、注意事项 1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然 蛋白，可选择非融合表达。 2 、融合表达时在选择外源 DNA 同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干 扰。 如何做原核表达（ prokaryotic expression ） 2010-03-26 22:54:25 来源： 易生物实验 浏览次数： 673 网友评论 0 条 首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌