《层析(包括：吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等)》.ppt

欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质L（配体）以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L-S，其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S复合物。根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法称为亲和层析。 亲和层析是利用配基、配体之间专一可逆结合性质进行物质分离的方法,因此其专一性、选择性是极高的。 柱体积小，上样量大，洗脱流速快，操作步骤少 缺点是要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体之后方可进行 1、选 择 配 基； 2、选择偶联凝胶； 3、偶 联 配 基； 4、装填合适的柱； 5、平衡（2-3倍体积缓冲液）； 6、应 用 样 品； 7、洗涤未结合物质； 8、洗脱结合物质→除盐； 9、再生；　　 一般推荐使用的程序如下： 吸附层析 （absorption chromatography） 任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此表面密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得到分离的现象就叫吸附层析 是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法 吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开 凡能将其他物质聚集到自己表面的物质称吸附剂,包括硅皮,氧化铝,活性炭,淀粉,纤维素及陶土;而聚集于吸附剂表面的物质称被吸附剂. 吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外,还有化学作用,如DNS-氨基酸双向聚酰胺薄膜层析中被分离的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之间形成氢键. 常用术语：（p37-38） 固定相，流动相，层析，操作容量，床体积，洗脱体积 外水体积，内水体积，基质体积，膨胀度， 分配系数和迁移率 吸附剂： 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行选择，极性强的易吸附极性强的物质，非极性的易吸附非极性的物质。 吸附剂的活化，使用前需要活化，如硅胶，可在高温烘烤 1、吸附柱层析 2、薄层层析（TLC）：是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，液体为流动相的一种层析方法。 特点： 展开时间短 设备简单、操作方便 温度变化和溶剂饱和度对Rf值影响较小 可使用腐蚀性显色剂 灵敏度高 分类： 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。 聚酰胺薄膜层析 聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过程，因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。 聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡，然后用多元缓冲液进行洗脱，多元缓冲液pH呈梯度下降。 聚焦层析 聚焦层析所用凝胶主要有两种：MONOP和多元缓冲液交换剂（PBE）。其中MONOP是带孔小珠，孔中被带正电荷的胺基填充，适用于高效聚焦层析。多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶，适用作普通聚焦层析的介质。 聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多元缓冲交换剂。 聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成，蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故pH梯度溶液可以自动形成。 例 如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。 1、pH梯度溶液的形成 照此处理几段时间，从层析柱顶部到底 部就形成了pH6-9的梯度。随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的pH梯度也就消失了。 蛋白质所带电荷取决于它的等电点（pI） 和层析柱中的pH值。当柱中的pH低于蛋白质的pI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。当蛋白质移动至环境pH高于其pI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。 随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。 2．蛋白质的行为 蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫聚焦效应。pH梯度的形成