微生物学实验1口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用细菌的革兰氏染色.pptVIP

注意事项 1. 载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。 2. 取样时只需轻刮牙齿表面，肉眼可见少许牙垢即可，滴水不宜过多，以免干燥时间过长；涂片不宜过厚，以免水洗不完全造成背景杂乱。 3. 自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。 4. 染色过程中勿使染色液干涸。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 微生物学实验1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用细菌的革兰氏染色 本课程的成绩考核： 基础实验：60% 由单个实验的成绩相加组成。每次实验由实验指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等进行评定，具体比例为：实验出勤及实验态度占20％；实际操作30％；实技能考核30％；实验报告占20％。 自主设计实验：40% 设计实验方案 实验操作 总结 实验一 细菌的革兰氏染色 实验目的 实验原理 实验材料 实验方法 实验结果 注意事项 实验报告 思考题 微生物学实验-1 1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 2. 学习并掌握革兰氏染色技术，进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。 实验目的 革兰氏染色法（Gram staining）是微生物学中常用的一种染色方法，该染色法由丹麦医生（Christian Gram）于1884年创立，故名。 实验原理 G+细菌 G-细菌 革兰氏染色机理 G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，因不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内，使其呈现紫色。 G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，结晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时再经番红复染，就使G-细菌染成红色，而G+细菌仍呈紫色。 结晶紫初染 全部细胞紫色 碘液媒染 全部细胞紫色 乙醇脱色 G- 菌无色 G+ 菌紫色 番红复染 G- 菌红色 G+ 菌紫色 革兰氏染色各步骤时细菌的外观 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 番红复染 结晶紫 碘液 乙醇 番红 菌种 大肠杆菌 （Escherichia coli） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 试剂： 蒸馏水； 草酸铵结晶紫染液 ；卢戈氏碘液 95%乙醇； 番红复染液；香柏油；二甲苯 光学显微镜 实验材料 革兰氏染色操作步骤 水洗 干燥 镜检（油镜） 涂片 滴水 取菌 火焰固定 结晶紫染色1分钟 水洗 碘液1分钟 乙醇脱色（20~30秒） 水洗 番红1分钟 水洗 实验方法 自然干燥 E.coli S. aureus 混合菌 涂片方法示意图 分辨率 D= —— 数值孔径 NA＝n×sin— a n=1.515 空气n=1 λ 2NA 2 a 电源 电源 显微镜油镜的使用与保护 插上电源插头，打开显微镜电源开关。 调节显微镜光源。 先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm ，加香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。 换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压及装片。 观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。 油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。 7. 使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗，关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。 金黄色葡萄球菌(G+) 大肠杆菌(G-) 实验结果 大肠杆菌(G-) 和金黄色葡萄球菌(G+) 注意事项 1. 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。 2.染色过程中勿使染色液干涸。 3.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，会使阳性菌被误染成阴性菌。 4. 选用培养18~24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应。 实验报告 Escherichia coli 10×100 Staphylococcus aureus 10×100 混合菌 10×100 1．通过本