牛体外受精胚胎及克隆胚胎发育过程中组蛋白修饰表观遗传-….pdf

作者姓名： 吴侠 论文题目： 牛胚胎发育过程组蛋白修饰及克隆胚胎表观遗传重编程的 作者简介 ：吴侠，男， 1980 年 09 月出生， 2003 年 07 月师从于内蒙古 大学旭日干教授，于 2008 年 07 月获博士（硕士）学位。 随着十年前第一只体细胞克隆哺乳动物的诞生，近年来，体细胞核移植技术已 经在其他物种中得到实现，且体细胞核移植技术已经越过了种属的界限。但就目前 的技术水平而言，体细胞克隆胚胎怀孕率低、出生后胎儿异常的问题依然没有解 决，这些问题的存在严重制约了体细胞克隆技术的广泛应用。许多研究证实，供体 细胞核在受体卵母细胞中的不完全或异常表观遗传重编程是导致克隆胚胎发育异常 的重要原因。基因组 DNA 甲基化、组蛋白的共价修饰是重要的表观遗传修饰，二 者具有复杂而广泛的生物学功能。正常生殖细胞发生及胚胎发育过程，染色体要经 历广泛的 DNA 甲基化、去甲基化，核小体核心组蛋白也要通过各种共价修饰调节 染色体功能，从而完成遗传信息的传递和调控胚胎的发育。目前，对于克隆胚胎重 编程机理的研究还处于初级阶段，虽然证实克隆胚胎存在 DNA 甲基化的异常，但 是组蛋白共价修饰是否也存在异常，还不是很清楚。为了深入探讨克隆胚胎组蛋白 修饰的重编程，进而改善克隆效率，阐明胚胎的发育机理，本研究探讨了牛卵母细 胞体外成熟、体外受精及胚胎体外发育过程中组蛋白修饰的动态变化，比较了体外 受精胚胎与克隆胚胎早期发育过程中组蛋白修饰的差异。使用组蛋白去乙酰化酶抑 制剂对供体细胞及受体卵母细胞进行了处理，检测了药物对供、受体表观遗传修 饰，以及克隆胚胎发育的影响，并对处理后供体核在去核卵母细胞中组蛋白修饰的 重编程进行了分析。 1. 牛卵母细胞减数分裂、体外受精及胚胎体外发育过程中组蛋白修饰动态变化的 研究 本研究探讨了组蛋白 H3、 H4 不同甲基化、乙酰化修饰位点在牛卵母细胞成 熟、体外受精及胚胎体外发育不同阶段的动态变化。结果显示，组蛋白 H3、H4 甲 基化，乙酰化具有明显的阶段性变化。牛卵母细胞成熟过程不同组蛋白不同修饰位 点经历阶段的，特异性去乙酰化，组蛋白甲基化则在卵母细胞成熟过程中没有明显 变化。精卵融合，精子核解凝集，重凝集，乙酰化组蛋白 H3、H4 迅速定位于雄性 染色体，随后强的乙酰化信号定位于雄原核。卵母细胞恢复减数分裂，排出第二极 体，除 H4K5ac，没有检测到其他乙酰化信号，染色质凝集，检测到弱乙酰化信号 （H3K9ac、H4K5ac、H4K8ac），随后，雌原核也表现为强的乙酰化修饰。精子核 膨大和再凝集，没有检测到 H3K9me2 ，H3K4me3 荧光信号，原核形成，雄性染色 体组蛋白逐渐被甲基化。卵母细胞减数分裂恢复及原核形成过程维持了高的组蛋白 甲基化水平。胚胎发育，乙酰化的组蛋白存在于牛胚胎发育的各个时期，组蛋白 H3K9ac，H3K18ac 在 8 细胞期明显减弱，桑葚胚增强。 H4K8ac，H4K5ac 在胚胎 发 育 的 不 同 阶 段 都 具 有 较 强 的 荧 光 信 号 。合 子 基 因 组 激 活 前 ，细 胞 间 期 ， H4K8ac、H4K5ac 定位于细胞核周边，有丝分裂期， H4K8ac 定位于凝聚染色体末 端， H4K5ac 信号明显减弱。 H3K18ac、H4K8ac、H4K5ac 在囊胚滋胚层的染色较 内细胞团强。与组蛋白乙酰化相比， H3K4me3 在合子基因组激活后几乎完全消 失，而 H3K9me2 则明显增强。上述结果表明，卵母细胞成熟有其特异的组蛋白修 饰动态转变，组蛋白乙酰化逐渐被去除；受精是组蛋白甲基化、乙酰化逐渐恢复的 过程，且不同修饰位点有其自身的动态变化特点；胚胎发育过程维持了组蛋白乙酰 化、甲基化修饰，受精及胚胎发育过程中，相同组蛋白的不同位点有相似的调控模 式（ H3K9ac vs H3K18ac ；H4K8ac vs H4K5ac ）；功能相关的不同组蛋白修饰有其 类似的动态变化（ H3K9ac、H3K18ac vs H3K4me3 ），并且组蛋白乙酰化在细胞核 中的定位与合子基因组激活