用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体.docVIP

时间： TIME \@ "yyyy'年'M'月'd'日'" 2021年3月13日 学海无涯 页码：第 PAGE 1页共 NUMPAGES 1页 PAGE PAGE 1 用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体 关键字： 啮齿动物 　　查菲埃立克体是1987年报道的人单核细胞埃立克体病的病原体［1］，于1991年在美国被分离鉴定和定名［2］。该病临床表现主要为发热、头痛、肌痛，实验室检查有白细胞减少、血小板减少和转氨酶升高。现已证明美洲花蜱（Amblyomma americanum）和变异革蜱（Dermacentor variabilis）可以作为查菲埃立克体的传播媒介，白尾鹿（Odocoileus virginianus）可能是其动物宿主［3］。目前报道的病例主要分布于美国南部，在欧洲、非洲亦有病人出现，我国尚无该病例的报道，但南方很多地区的自然环境、气候条件及蜱种均与美国该病流行区极为相似，在云南和福建的蜱中检测到查菲埃立克体DNA特异片段［4］。为了解这些地区是否有查菲埃立克体自然疫源地的存在，及蜱类和野生动物的感染情况，我们应用半套式PCR技术，检测蜱及野生动物中查菲埃立克体DNA，对特异片段克隆后，进行序列分析，现将结果报告如下： 　　1　材料和方法 　　1.1　现场情况　调查点位于闽西北武夷山南麓山地，海拔300～700m，年平均温度为17.6℃，相对湿度80％左右，年降雨量1600mm，植被以针、阔混交林为主，山多林深，气候湿润，是动物繁殖和昆虫孳生的适宜场所，存在多种自然疫源性疾病。 　　1.2　标本的收集　蜱标本系1997～1998年间从林区草丛采集的游离蜱及从家畜和野生动物宿主（山麂、山羊、野猪、野兔、狗、牛、狐狸等）体表捉到的寄生蜱，共计755只，经鉴定，按种类和宿主分组检测。野鼠和野兔系同期在该地捕获，现场解剖，取脾和血块冷藏保存，脾脏39份，血块35份。野生动物种类及数量见表1。 　　1.3　PCR引物　参照文献［5、6］　构建查菲埃立克体16S rRNA基因特异引物，外引物HE1和PER2可扩增587bp的片段，HE1和HE3进行半套式PCR可扩增390bp的片段，引物的序列如下（根据M73222）： 　　HE1（49-77）5?-CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT-3? 　　HE3（438-412）5?-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3? 　　PER2（635-613）5?-CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT-3? 　　引物由军事医学科学院生物工程研究所合成。 　　1.4　PCR模板的制备 　　1.4.1　蜱标本　将蜱用75％的酒精浸泡30min后，用无菌生理盐水洗3次，吸血蜱1只1组，未吸血蜱2只或5只1组，用研磨器研碎，加入含蛋白酶K 100μg／ml的TE 300μl，55℃水浴1h，用酚：氯仿法抽提，两倍体积无水乙醇沉淀，70％酒精洗涤，干燥后，加50μlTE溶解，－20℃贮存备用。 　　1.4.2　野鼠脏器及血块标本　以无菌操作取野鼠脾脏3mm见方小块，用研磨器研碎（冻融的血取100μl），加蛋白酶K消化液（0.1m M Tris-Cl pH8.0，0.5μm EDTA pH8.0，0.5％ SDS，100μg／ml蛋白酶K）300μl，55℃水浴3h，中间多次振荡，至清亮无可见组织块，抽提及以后步骤同蜱标本处理。 　　1.5　PCR扩增　第一轮扩增，取上述DNA模板3μl，10×PCR缓冲液3μl，引物（HE1和PER2）浓度为0.1μmol／L，dNTPs 50μmol／L，总反应体积为30μl。扩增条件：95℃预变性180s，94℃ 60s，56℃ 75s，72℃ 70s扩增35个循环，最后72℃延伸7min。取第一轮扩增产物1μl为模板进行第二轮扩增，方法条件均同第一轮（引物为HE1和HE3）。两轮产物各取10μl，用含溴化乙锭的1.4％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 　　1.6　PCR产物的克隆与序列测定　用低熔点琼脂糖凝胶法回收第二轮PCR扩增产物，经纯化，连接到pGEM-T载体（美国Promega公司产品）上；将重组质粒转化感受态宿主E.coli XL1-blue（美国Ivitogens公司产品），转化子在含X-gal和IPTG（美国Promega公司产品）的平板上以蓝、白斑法筛选。挑取白色菌落，以HE1和HE3为引物做PCR快速鉴定，取阳性克隆，液体培养增菌；用QIApreg试剂盒（德国QIAGEN公司产品）提取双链重组质粒DNA，应用373A自动测序仪测序。 　　1.7　DNA同源性比较　通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心（NCBI）站点后，利用BLAST工具，