i基因文库与筛选.pptx

对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。;为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。 ;目的基因： 已知基因： 未知基因：构建基因文库 特定探针的制备 文库的筛选（筛库） 含目的基因的克隆 ;南京林业大学;南京林业大学;南京林业大学;南京林业大学;基因文库的好坏要看该文库是否覆盖起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作丧失其中的基因或某些序列。 构建基因文库时，一个最重要的指标就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆盖所有原初序列(代表性文库)?如果某些序列如缺少限制性酶切位点的重复序列未被克隆，这样的文库就不具代表。 同样如果文库中未能含有足量的克隆，则极有可能会丢失某些基因。富含某种序列的cDNA文库显然会缺少其他一些基因，但若正确制备并扩增，也可以成为富含mRNA起始材料的具代表性的文库。;南京林业大学;N=ln(1-P)/ln(1-f);南京林业大学;南京林业大学;I1-4载体;附：原核生物基因组DNA文库的构建;（二）基因组DNA的不完全酶切;（三）酶切片段与克隆载体连接;2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择　;（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞;２、重组质粒转化受体细胞;（五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选;2）文库在液体培养基中扩增保存;3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中;南京林业大学;通常不用原核mRNA来构建cDNA文库，因为原核mRNA通常不稳定；相比之下则较易制备基因组文库，且可包含所有基因组序列。 从真核mRNA构建cDNA是非常有用的，因为cDNA不含内含子序列，可被用来在大肠杆菌中表达编码蛋白。;cDNA基因文库构建的步骤;cDNA文库的构建：;;南京林业大学;南京林业大学;mRNA在细胞中的丰度;南京林业大学;南京林业大学;第一链cDNA的合成;引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列;南京林业大学;基因组DNA文库;1 基因组DNA文库的优点;2 cDNA文库的主要优点;3 cDNA克隆的主要的缺点;南京林业大学;克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。;南京林业大学;南京林业大学;南京林业大学;南京林业大学;南京林业大学;;扣除文库(subtractive library);扣除杂交（Subtractive Hybridization） ;Section I: Gene libraries and screening;Section I: Gene libraries and screening;染色体步移 ;南京林业大学;附：原核生物基因组DNA文库的构建;（二）基因组DNA的不完全酶切;通常不用原核mRNA来构建cDNA文库，因为原核mRNA通常不稳定；相比之下则较易制备基因组文库，且可包含所有基因组序列。 从真核mRNA构建cDNA是非常有用的，因为cDNA不含内含子序列，可被用来在大肠杆菌中表达编码蛋白。;引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列;南京林业大学;南京林业大学;Section I: Gene libraries and screening