分生实验技术试验课件1.pptx

分子生物学实验技术课程要求及安排不迟到，不早退，有事需上交请假条；2.主动认真参与实验，积极思考；认真书写并按时上交实验报告，每个小组上交一份，于第五周周二至周三，交至第7实验室；每次实验15分，按参与程度以及实验报告的完成情况打分，迟交将扣分。4次实验主要包括Western Blot， Southern Blot，分子克隆，表达蛋白质及其纯化。实 验 一蛋白质印迹/免疫印迹Western blotting/Immunoblotting电泳转膜封闭，加一抗 清洗，加二 抗清洗，底物显色（曝 光）结果分析基本操作流程提取组织或细胞蛋白，蛋白含量测定制备SDS凝胶蛋白质变性，电泳分离蛋白质实验时间安排 1. SDS胶制备 2. 样品蛋白质含量测定 3. 电泳 4. 提取小鼠基因组DNA 1. 转移电泳 2. 蛋白质胶考马斯亮蓝染色分析 3. 膜封闭 4. 加一抗（过夜温浴4℃） 1. 洗膜、考马斯亮蓝染色胶脱色 2. 加酶标二抗（温浴37 ℃ ，1h） 3.洗膜与显示 4.结果分析第一天第二天第三天CH2CH2[CH2CHCHCH]nCH2CH[CH2CH]nCCOOCCOOCONHNH2NHNH2NH2CH2CH2NHNHCOCO[CH2CH]nCH2[CH2CH]nCH2CH[CH2CHCH2CHCCOOCONHNH2NH2CH2NHCOCH2CH 实 验 原 理第一部分：1. SDS（polyacrylamide gel electrophoresis ）AcrylamidepolyacrylamideN,N'-Methylene Bisacrylamide 实 验 原 理 实 验 原 理SDS浓度与分离蛋白质范围丙烯酰胺浓度（％） 线性分离范围（kD） 1510~431212~601020~807.536~945.057~212 实 验 原 理第一部分：SDS电泳2、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同蛋白在不同pH下表现出不同的电荷；为使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，上样前应进行处理，即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上样缓冲液。经高温处理，使SDS 与蛋白质充分结合，蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构，同时使整个蛋白带上负电荷，电泳时凝胶中所含的SDS负电荷多肽复合物向正极泳动。 实 验 原 理第一部分：SDS电泳3. 蛋白样品处于 pH6.8 压缩胶的上层，pH8.8 的分离胶层在下层。由于pH不连续和胶孔径大小不连续，在浓缩胶泳动时，Pro-受阻小，在慢离子（Gly-）和快离子（Cl-）的共同作用下，不同蛋白质可在压缩胶上被压缩成一薄层，使全部蛋白质在进入分离胶前位于同一“起跑线”上；当蛋白质进入分离胶时 ，不同蛋白以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异， 最终达到彼此分开 。 实 验 原 理第二部分：样品的印迹（转膜）1. 选择适当的膜并进行预处理： NC膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液浸泡，使NC膜得到彻底浸润，一般5 分钟以上。 PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约 1-2 分钟。价格便宜硝酸纤维素膜简单快速封闭非特异性抗体结合膜的选择 0.45um和0.2um孔径 PVDF膜价格昂贵特点蛋白较硝酸纤维膜的结合能力强背景较NC膜深洗脱抗体后可再使用 实 验 原 理第二部分：样品的印迹（转膜）2. 电流 1mA-2mA/cm2，通常 200mA/膜，按照 目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间。目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间（h） 801408%1.52.025 8010%1.515 4012%0.75﹤2015%0.5 实 验 原 理第三部分：特异抗体与抗原（靶蛋白）结合、显色 转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹(blot), 用于对蛋白质的进一步检测。封闭后，用针对目的蛋白的特异抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的目的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。 清洗后，再用适当标记的二抗处理（二抗是指抗一抗的抗体），与适当底物溶液反应后即可产生可见区带，指示目的蛋白的位置。 Western Blotting 化学增强发光，X光胶片曝光显影结果实 验 操 作一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS, SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis1. 胶模准备与灌胶： 取制胶玻板，平板、凹板各一；平板板平置桌面，左右和底部各放一塑料垫条（为防止胶液泄漏，可以在塑料垫条的两面都涂上一层薄薄的凡士林）；然后盖上凹板，底部对齐,左右和底部三侧用夹子夹紧，直立于桌面上。轻摇混匀后，8μL TEMED，再次混匀后立即加入玻板中