研究生免疫组织化学染色技术.pptx

免疫组织化学的应用 IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。武汉大学病理教研室实验名称链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达武汉大学病理教研室S-P法原理示意图过氧化物酶链酶亲和素生物素生物素化二抗特异性一抗待测抗原武汉大学病理教研室组织、细胞标本 抗原修复 阻断内源性过氧化物酶 滴加二抗 滴加特异性一抗正常血清封闭 滴加三抗显色复染封片 免疫组织化学基本实验流程武汉大学病理教研室具体步骤如下：　1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；　2．所有组织均采用微波修复抗原； 　3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；　4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒孵育 10min；　5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；　6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；武汉大学病理教研室　7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；　8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；　9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵育 15min， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min ；　10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，苏木素复染；　11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；　12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。武汉大学病理教研室实验流程中的注意事项内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间检测及显色系统复染 武汉大学病理教研室染色前处理 －取材、脱水、浸蜡组织及时固定 固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛常规下固定8-24小时取材厚度：2mm武汉大学病理教研室染色前处理 －预防脱片常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度武汉大学病理教研室染色前处理 －包埋与切片 包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时（迈新）；或60℃过夜武汉大学病理教研室染色前处理 －切片保存切片不宜长时间在常温下保存武汉大学病理教研室染色前处理 －脱腊原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开武汉大学病理教研室实验操作中的应用抗原修复 实验操作中的注意事项 武汉大学病理教研室抗原修复 影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类 1）酶消化法 2）加热法（高压法?水煮法?微波法）抗原修复液的选择 1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0） 武汉大学病理教研室内源性过氧化物酶的灭活 存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟武汉大学病理教研室血清封闭 目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用 武汉大学病理教研室冲 洗 一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗增加效果 可加入Tween20武汉大学病理教研室一抗孵育时间及抗体选择应选择信誉高、质量好的试剂公司抗体切忌反复冻融一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜武汉大学病理教研室检测及显色系统一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法。如SP、LSABC、ABC等 显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测 武汉大学病理教研室显色系统常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-----棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-----砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色武汉大学病理教研室复 染原则：注意两者之间对比，突出阳性信号武汉大学病理教研室实验对照设计原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照编号阳性片待检片阴性对照结论1－－－操作失误，抗体失效2＋＋＋非特异性着色3－＋－阳性片不含靶抗原4＋－－待检片不含定位抗原5＋＋－待检片含定位抗原武汉大学