选修三-基因工程基本操作程序讲课用.ppt

选修三-基因工程基本操作程序讲课用 选修三-基因工程基本操作程序讲课用 一、目的基因的获取 (一)、目的基因主要是______________________ 编码蛋白质的基因 请举出三个以上的例子 （二）、获取目的基因的常用方法有哪些? 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成 请阅读P8、9 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 1.基因文库：概念见P9 2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类 种类 基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库 3.基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 4.获取目的基因的根据： 见课本P9 5.基因文库的构建方法之一 （1）直接分离法(鸟枪法) 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物基 因组文库 反转录法：cDNA的合成流程图解 5.基因文库的构建方法之 mRNA 与载体连接导入受体菌群 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA (cDNA) 该生物 cDNA文库 基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较 1、 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 2、原理： DNA复制 二、利用PCR技术扩增目的基因 四种脱氧核苷酸(dNTP) 一对引物： 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 模板DNA( 需含有目的基因 ) Mg2+(激活剂) 3.条件： 缓冲溶液 一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 4.前提： 5/ 3/ G—G T—C 3/ 5/ G—A C—C 5/ 3/ 引物Ⅱ G—G 变性 复性 延伸 1.变性(90---95度)：目的基因DNA受热变性，解链为单链； 2.复性（55---60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合； 3.延伸（70---75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，从5′端→3′端进行延伸。 5/ 3/ A—G 引物Ⅰ 5、扩增过程 2、具体过程 PCR(多聚酶链式反应) ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.等 ②原理：__________ ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件） ⑥过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 PCR技术扩增与DNA复制的比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原理 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 3、人工合成的目的基因 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ______