生物制药学第五章--固相析出分离法.ppt

第二节 有机溶剂沉淀法 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 优点： 产品更纯净；易分离；分辨能力比盐析法高；沉淀不用脱盐。 缺点： 易使蛋白质变性；需在低温下进行；易燃易爆；成本高，有一定毒性。 A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 < D水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。 B 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。 C 相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。 一、有机溶剂沉淀法基本原理（p174） 有机溶剂沉淀法机理 降低介电常数 破坏水化膜 二、影响沉淀效果的因素 有机溶剂种类及用量 pH值 温度 无机盐含量 金属离子 样品浓度 1、有机溶剂种类及用量 选择原则： 水溶性要好（与水无限混溶） 介电常数要小 致变性作用要小 毒性要小、挥发性适中 用量计算： 2、溶液pH值： 目标蛋白与杂质带有相同的电荷，一般pI附近 3、温度：（预冷） 低温防止变性，有利于提高收率（溶解度下降）；（有机溶剂溶于水放热） 4、无机盐含量: 离子强度低有利于沉淀，－ 5、金属离子助沉淀作用： Ca2+、Zn2+等多价阳离子。 6、样品浓度－2% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 举例：固体发酵生产α-淀粉酶的提取工艺研究 α-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液  加乙醇（70%）搅拌 α-淀粉酶↓ * pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6.5 pH * 适宜的pH 5.6 ~ 6.0 * 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T℃ * 适宜的温度10 ~ 20 ℃ 有机溶剂沉淀实例 第三节 其他沉淀方法 1.等电点沉淀 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层破坏和水化膜变薄，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。 等电点沉淀法只适用在等电点时溶解度很低的两性生化物质，如酪蛋白。 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 （2）溶质的稳定性 （3）由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用。 2、成盐沉淀法 金属离子沉淀、有机酸类复合盐沉淀 3、亲和沉淀 加入载体-配基复合物 4、高分子聚合物沉淀法 PEG、Dextron、PVPP等。 5、表面活性剂沉淀法 LOGO 生物制药学第五章--固相析出分离法 固相析出分离法 盐析法 有机溶剂沉淀法 其他沉淀方法 结晶法 等电点沉淀法 成盐沉淀法 表面活性剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法 亲和沉淀法 第一节 盐析法 一、基本原理 盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。 蛋白质溶液 加入中性盐 低盐，盐溶 高盐，